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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的: 研究小鼠关节软骨相关非编码微小RNA(microRNA,miRNA)miRNA-320-3p是否通过调控高迁移率族蛋白1(high-mobilitygroupbox1,HMGB1)的表达进而调节小鼠关节软骨细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)降解过程,并探讨其调控作用及机制。 方法... 展开 目的: 研究小鼠关节软骨相关非编码微小RNA(microRNA,miRNA)miRNA-320-3p是否通过调控高迁移率族蛋白1(high-mobilitygroupbox1,HMGB1)的表达进而调节小鼠关节软骨细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)降解过程,并探讨其调控作用及机制。 方法: (1)获取小鼠关节软骨,经处理并按比例加入胶原酶后置于培养箱中培养,分离培养软骨细胞,每隔24小时更换一次培养液,选取第2代软骨细胞进行实验; (2)通过白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)刺激小鼠软骨细胞,培养24h后收集细胞,运用Trizol法进行软骨细胞总RNA的提取; (3)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR)检测miRNA-320-3p、HMGB1mRNA、MMP13以及Col2a1的表达变化情况; (4)分别转染miRNA-320-3p模拟物及其空白对照、miRNA-320-3p抑制物及其空白对照,观察miRNA-320-3p调控软骨细胞HMGB1mRNA、MMP13以及Col2a1的表达;Westernblot实验检测HMGB1蛋白的表达水平; (5)通过双荧光素酶报告的相关实验检测验证miR-320-3p与HMGB1mRNA3''非编码区(untranslatedregion,UTR)的直接结合情况。 结果: 与正常的关节软骨组织相比较,miRNA实时荧光定量PCR结果显示,mimic组miRNA-320-3p表达量呈现上调趋势,inhibitor组miRNA-320-3p表达呈现为下调趋势,比较差异具有明显统计学意义(P<0.001),同时表明了miR-320-3p过表达和低表达小鼠关节软骨的细胞模型构建完成;与正常对照相比较,在骨关节炎的软骨组织中miR-320-3p的表达量相对下降,HMGB1mRNA的表达量相对上升(P<0.05);经过IL-1β处理的小鼠骨关节软骨细胞的miRNA-320-3p表达量下降,HMGB1mRNA的表达量上升,与未经过IL-1β处理的小鼠骨关节软骨细胞相比较差异均有统计学意义(P<0.05);经IL-1β处理过的小鼠关节软骨细胞中的Col2a1的表达下调,而软骨细胞外基质分解代谢的标志物MMP13的表达上调(P<0.001)。Westernblot实验显示HMGB1的表达量在mimic组显著下调,在inhibitor组的表达量明显增加。转染miR-320-3p模拟物后,小鼠关节软骨细胞内的HMGB1mRNA及MMP-13表达均降低(P<0.05),而Col2a1的表达增高(P<0.01);而转染miRNA-320-3p抑制物后,软骨细胞内的HMGB1mRNA及MMP-13表达均增高(P<0.01),而Col2a1的表达降低(P<0.01)。通过荧光素酶报告实验验证,突变型的结合位点,过表达miRNA-320-3p后荧光素酶活性均没有明显变化(P>0.05);野生型的结合位点,过表达miRNA-320-3p后荧光素酶活性降低(P<0.01)。 结论: miRNA-320-3p是一种与关节软骨退行性改变相关的miRNA,miRNA-320-3p可通过靶向软骨细胞HMGB1的表达,介导软骨细胞外基质的降解过程进而抑制或缓解骨关节炎的发生。 收起
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