摘要: 沉香是瑞香科（Thymelaeceae）沉香属（Aquilaria）或拟沉香属（Gyrinops)植物受伤害后形成的含有芳香性树脂的木材，广泛应用于医药、香料、宗教文化和工艺品领域。白木香（Aquilariasinensis（Lour.）Gilg）是《中国药典》收载的药用沉香植物来源，... 展开 沉香是瑞香科（Thymelaeceae）沉香属（Aquilaria）或拟沉香属（Gyrinops)植物受伤害后形成的含有芳香性树脂的木材，广泛应用于医药、香料、宗教文化和工艺品领域。白木香（Aquilariasinensis（Lour.）Gilg）是《中国药典》收载的药用沉香植物来源，是典型的伤害诱导型药用植物。沉香的形成实质是木材中倍半萜类和2-（2-苯乙基）色酮类（2-（2-phenylethyl）chromones,PECs）成分缓慢合成和积累的过程。PECs也是沉香的特征成分和主要活性成分，除沉香及其基原植物外，目前仅在其他5种植物中有报道。其具有广泛的药理活性，如神经保护、乙酰胆碱酯酶抑制、抗炎和抗菌活性等。白木香有普通和奇楠两种种质，普通种质是目前研究最多、最透彻的沉香树种;奇楠种质具有伤害后易结香特性，且所结奇楠香具有PECs含量高的特点;故二者相结合有利于PECs的相关研究。近年来，沉香倍半萜类物质的生物合成途径已被基本阐明，但PECs的生物合成通路仍未见报道，严重制约了沉香形成机制的全面揭示。 PECs是色酮（苯并-γ-吡喃酮）的2位苯乙基取代物，属于聚酮类化合物，且骨架结构（C6-C5-C6）与黄酮类化合物（C6-C3-C6）相似，故我们推测PECs的生物合成机制可能与黄酮类似:由植物Ⅲ型聚酮合酶（polyketidesynthase,PKS）催化苯丙烷代谢中间产物和丙二酰辅酶A缩合生成骨架结构。为此，本课题通过对白木香普通种质和奇楠种质的转录-代谢联合分析，筛选可能催化PECs骨架结构合成的PKS基因及参与相关底物合成的苯丙烷代谢通路基因;并结合基因家族系统研究锚定PECs骨架结构合成的候选PKS基因;最后进行候选基因编码蛋白的酶活性鉴定，一方面确定PECs骨架结构合成的关键酶，另一方面实施底物组合合成反应,探究酶的催化杂泛性。主要研究成果如下: （1）白木香普通种质和奇楠种质在伤害诱导下产生的PECs的组成和含量积累模式差异大，且基因表达谱明显不同。代谢组分析显示，奇楠种质在伤害胁迫下的代谢过程较普通种质活跃。其中，PECs在普通种质和奇楠种质样本中的组成及含量积累模式显著不同，特别是2-[2-（4-甲氧基苯）乙基]色酮（PEC33）在奇楠种质中的含量远高于普通种质。全长转录组分析显示，普通种质和奇楠种质在伤害早期（6h）均含有大量差异表达基因（differentlyexpressedgenes,DEGs）。但随着时间延长，普通种质DEGs数目急剧下降，5d时绝大多数基因已恢复至健康水平;而奇楠种质在其他时间点仍具有大量DEGs。此外，可能参与PECs生物合成的大多数苯丙烷代谢通路基因在奇楠种质样本中具有更高表达量。 （2）初步筛选了4个PECs骨架结构合成的聚酮合酶基因和47个参与PECs底物合成的苯丙烷代谢通路基因。通过加权基因共表达网络分析分别从普通种质和奇楠种质中鉴定了4个和5个与PECs具有较高相关性的基因模块。基因注释结果显示，普通种质中与PECs正相关的4个模块共含有1个PKS基因（AsPKS8）和32个苯丙烷代谢途径基因，奇楠种质中的五个模块共含有3个PKS基因（AsPKS3、AsPKS4、AsPKS5）和36个苯丙烷代谢途径基因。将两种种质筛选的基因合并去重后，获得4个AsPKSs(AsPKS3、AsPKS4、AsPKS5、AsPKS8）及47个苯丙烷代谢通路基因。 （3）对白木香Ⅲ型聚酮合酶基因家族进行系统分析，锚定了7个AsPKSs作为PECs骨架结构合成的候选关键酶基因。对AsPKS基因家族成员进行了生信、基因表达特性和亚细胞定位分析。13个AsPKSs在进化树上被划分为查尔酮合酶（chalcone-producingsynthase,CHS）类和非查尔酮合酶（nonchalcone-producingsynthase,non-CHS）类。其中AsPKS3、4、5和6聚在non-CHS类的同一簇，而AsPKS7、8和11聚在CHS类的同一簇。AsPKSs启动子区域存在较多防御相关的光响应、非生物应激响应和激素响应元件。AsPKSs具有不同的组织表达特性和通体结香技术处理下的诱导表达特性，显示它们可能在白木香中参与不同的生物学过程，且AsPKS3-5是最具潜力的PECs骨架结构合成酶基因。此外，MeJA和SA对AsPKS3、4、5、6、7和11表达量的上调作用比其他基因更强。综上，将受MeJA和SA显著诱导上调的AsPKS3、4、5、6、7和11与转录-代谢联合分析筛选出的AsPKS3、4、5和8合并，获得AsPKS3、4、5、6、7、8和11作为PECs骨架结构合成的最终候选关键酶基因。亚细胞定位结果表明，7个候选基因的编码蛋白均定位于细胞质，且其中non-CHS类的AsPKS3、4、5和6还定位于细胞核。 （4）体外功能研究表明non-CHS类AsPKS3-6和CHS类AsPKS7、8、11均能催化合成PECs前体物质（二芳基戊二酮）及苄基丙酮类、喹诺酮类、吡喃酮类和二芳基庚二酮类等多种结构不同的化合物，且AsPKS7、8和11还具有CHS活性。构建了7个候选AsPKSs的大肠杆菌原核表达系统，将获得的原核表达蛋白纯化后开展体外酶促反应实验，产物由LC-MS检测确定。结果显示，7个AsPKSs均能催化苯甲酰辅酶A与β-酮酸生成PECs的前体物质二芳基戊二酮，也均具有其他多种催化活性，且在系统发育树上聚在同一簇的PKSs表现出高度相似的催化活性。non-CHS类的AsPKS3-6均能催化不同的芳香酰辅酶A与丙二酰辅酶A合成苄基丙酮类或吡喃酮类物质;催化体积较大的N-甲基邻氨基苯甲酰辅酶A与丙二酰辅酶A/β-酮酸生成喹诺酮类物质;催化阿魏酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成姜黄素（二芳基庚二酮类物质）;催化不同芳香酰辅酶A与β-酮酸合成其他二芳基庚二酮类化合物。在此基础上，AsPKS6还能催化苯甲酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成CTAL型吡喃酮类化合物和二苯甲酮。CHS类的AsPKS7、8、11也能催化合成苄基丙酮类、喹诺酮类和二芳基庚二酮类化合物。但与non-CHS类AsPKS3-6明显不同的是，AsPKS7、8和11能催化不同芳香酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成系列黄酮类物质及CHS体外酶促反应常见的其他两类产物（BNY型毗喃酮和CTAL型吡喃酮类化合物），呈现CHS活性;还能催化N-甲基邻氨基苯甲酰辅酶A与三分子丙二酰辅酶A迭代缩合生成CTAL型生物碱;但不能催化合成姜黄素。 氨基酸序列比对和蛋白三维结构分析显示苜蓿查尔酮合酶（MsCHS）中的氨基酸残基Thr132、Ser133、Thr194、Thr197、Phe265、Ser338在non-CHS类APKS3-6中相应位置分别被替换为Ser134、Ala135、Asn196、Asn199/His199、Pro267/Ala267和Phe340,导致4个non-CHS类AsPKSs的活性腔入口和邻近空间均比MsCHS大。相反，CHS类AsPKS7、8、11的活性位点氨基酸和活性腔结构均与MsCHS相同。此外，酶动力学实验显示AsPKS3-5合成对羟基亚苄基丙酮和喹诺酮的最适pH和最适温度不同。实时荧光定量PCR检测结果显示，7个候选AsPKSs的表达量均受盐胁迫的显著上调。 综合以上结果，本研究克隆鉴定了7个新的可合成PECs前体且兼具多种体外酶活性的PKSs。亦是首次从自然界中鉴定了可催化合成PECs前体和生物碱的CHS类植物PKSs（AsPKS7、8和11）。本研究不仅促进了PECs生物合成途径和沉香形成机制的全面揭示，也为白木香中黄酮类、苄基丙酮类和喹诺酮类等聚酮化合物的生物合成途径解析及植物Ⅲ型PKSs催化机制研究提供了思路。 收起