摘要: 植物Ⅲ型聚酮合酶超家族(PKSs)，又被称为查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)超家族，能够催化合成多种植物次生代谢产物的分子骨架。查尔酮合酶能够催化1分子4-香豆酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A通过一步脱羧缩合以及克莱森环化反应生成柚皮素查尔酮，... 展开 植物Ⅲ型聚酮合酶超家族(PKSs)，又被称为查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)超家族，能够催化合成多种植物次生代谢产物的分子骨架。查尔酮合酶能够催化1分子4-香豆酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A通过一步脱羧缩合以及克莱森环化反应生成柚皮素查尔酮，同时也会伴有脱轨产物4-香豆酰甘油酸内酯CTAL(4-coumaroyltriacetic acid lactone)和丙烯酮非环化产物BNY(bis-noryangonin)产生。 本论文采用RACE方法从中药虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)中分离得到一个Ⅲ型聚酮合酶基因，命名为PcCHS，并对该基因的氨基酸序列、基因结构、进化关系和在紫外诱导下的基因表达模式了进行分析。结果表明:PcC HS基因cDNA全长为1182 bp，推测其编码一个含有393个氨基酸的蛋白，编码蛋白分子量约为43 kD，等电点为5.81。Blast序列分析显示，PcCHS与同科的何首乌FmCHS的相似性达到95％，与其它植物CHS的相似性为74％～94％。氨基酸序列分析表明，该基因具有Cys164、His303和Asn3363个活性位点及2个决定底物特异性的苯丙氨酸残基Phe215、Phe265。基因结构分析表明，PcCHS基因组DNA含有3个内含子和4个外显子，且3个内含子的位置保守。荧光定量PCR结果表明，在紫外诱导下，PcCHS基因在虎杖的茎和叶中的表达量分别提高了16和11倍，在根中的表达量基本不变。将PcCHS cDNA插入原核表达载体pET30a构建重组表达载体pET30a∷PcCHS，重组质粒转化大肠杆菌Transetta(DE3)，获得表达菌株。经IPTG(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)诱导表达后，对表达产物进行SDS-PAGE分析，用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化，纯化蛋白加入酶促反应体系进行体外酶促反应，HPLC检测体外酶促反应产物，未检测到PcCHS的产物。 收起