摘要: 虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)为多年生草本植物,曾是亚洲民间广泛应用的草药,具有活血镇痛、清热利湿、止咳化痰、活血化疲等功效。现代医学研究表明,虎杖主要有效成分为葸醌类、黄酮类和芪类等多酚类化合物。这些多酚类化合物是由Ⅲ型聚... 展开 虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)为多年生草本植物,曾是亚洲民间广泛应用的草药,具有活血镇痛、清热利湿、止咳化痰、活血化疲等功效。现代医学研究表明,虎杖主要有效成分为葸醌类、黄酮类和芪类等多酚类化合物。这些多酚类化合物是由Ⅲ型聚酮合酶催化合成基本骨架,再经过不同的下游修饰而生成。Ⅲ型聚酮合酶具有相似的基因结构,序列特征,它们的活性中心有保守的氨基酸,有类似的反应机制。目前,已经有21种植物Ⅲ型聚酮合酶被研究。分离分析虎杖中Ⅲ型聚酮合酶基因,对研究虎杖有效成分代谢途径,合理利用虎杖资源,发现新的Ⅲ型聚酮合酶和研究Ⅲ型聚酮合酶催化机制等方面都有重要意义。 本课题利用同源克隆的方法从虎杖中克隆到三个Ⅲ型聚酮合酶基因:查尔酮合酶基因(PcCHS)、白藜芦醇合酶基因(PcSTS)和另外一个功能未知的聚酮合酶基因(PcPKS3)。通过原核表达和蛋白纯化得到重组蛋白,对三个Ⅲ型聚酮合酶进行了功能鉴定和分析。 查尔酮合酶PcCHS与大黄CHS有92%的相似性,体外酶促反应能够催化p-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成查尔酮,同时能够检测到CTAL和BNY两种CHS体外反应中常见的副产物,说明我们克隆到的PcCHS具有查尔酮合酶活性,可能在虎杖黄酮类化合物代谢中起作用。PcCHS在体外磷酸缓冲液中的最适反应温度为40℃,适合pH值7.0-8.0,对底物p-香豆酰辅酶A kcat为10.0 min-1,Km为0.8μM,对底物丙二酰辅酶A Km为6μM。 白藜芦醇合酶PESTS与大黄STS有87%的相似性,体外酶促反应能够催化p-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成白藜芦醇,同时能够检测到CTAL、BNY和查尔酮副产物。体外的最适反应温度为50℃,适合pH值7.0,对底物p-香豆酰辅酶A.Kcat为26.3 min-1,Km为17μM,对底物丙二酰辅酶Akm为8.5μM。 通过进化分析PcPKS3在CHS-like分支,与大黄中芦荟松合酶(ALS)关系最近。在体外酶促反应体系中,以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物生成未知产物,该未知产物不稳定,放置96 h以上会转变为其它物质。通过Western分析,PcPKS3在虎杖的根、根茎和幼叶中表达。进一步的免疫组织化学分析,确定了PcPKS3在根的维管组织和根茎的皮层部位表达。PcPKS3在拟南芥中表达会明显抑制拟南芥根的伸长。HPLC-MS分析表明,PcPKS3在拟南芥中表达也会引起拟南芥代谢谱的变化。 本课题从虎杖中克隆了三个Ⅲ型聚酮合酶基因,并对其功能进行了初步分析。PcCHS和PcSTS的克隆对于研究虎杖中黄酮类化合物和芪类化合物代谢都非常有帮助。并且为通过工程微生物发酵的方法合成黄酮和白藜芦醇提供了候选基因。PcPKS3是一个新型的Ⅲ型聚酮合酶,其在体外和植物体内的功能还需要进一步研究。 收起