中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 杨宁中国科学院大学 2013年博士导师: 王台共285页

摘要 : 在开花植物的有性生殖过程中，发育成熟的花粉借助于风媒或虫媒被传粉至雌蕊的柱头，亲和的花粉在柱头上复水、萌发产生极性生长的花粉管，通过花粉管将两个精细胞运送至胚囊，启动双受精。此过程涉及花粉以及花粉管与雌蕊细胞的相互识别与互作。质膜... 展开在开花植物的有性生殖过程中，发育成熟的花粉借助于风媒或虫媒被传粉至雌蕊的柱头，亲和的花粉在柱头上复水、萌发产生极性生长的花粉管，通过花粉管将两个精细胞运送至胚囊，启动双受精。此过程涉及花粉以及花粉管与雌蕊细胞的相互识别与互作。质膜蛋白执行细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号传导和调控，以及能量传递等重要功能，在花粉及花粉管与雌性细胞的识别与互作过程中起着关键作用。因此，系统解析花粉与花粉管质膜蛋白质以及成熟与萌发花粉质膜蛋白的差异，对于进一步研究花粉与柱头的识别及花粉管极性生长的机制是十分重要的。本论文以水稻成熟和萌发花粉为材料，建立了适合大规模分离纯化花粉质膜的技术方法，分离纯化了成熟和萌发花粉的质膜，利用iTRAQ定量蛋白质组方法定性与定量解析了成熟与萌发花粉的质膜蛋白。在鉴定的1979个蛋白（1631个unique蛋白）中，1121个蛋白(899个unique蛋白)有预测的跨膜区或脂锚定结构域，也具有细胞质膜相关的亚细胞定位信息，是质膜相关蛋白。这些质膜相关蛋白主要涉及信号转导(25％)、离子运输(19％)、细胞壁代谢(12％)、囊泡运输(11％)以及细胞骨架动态(5％)等生物学过程。192个质膜相关蛋白（192个unique蛋白）在花粉萌发前后的丰度显著变化，其中119个在萌发花粉中上调，73个在萌发花粉中下调。这些上调的蛋白主要包含了信号转导蛋白、糖与磷脂运输通道蛋白，如:钙依赖蛋白激酶、生长素信号蛋白、磷脂酰肌醇激酶、磷脂酶D、CrRLK1L型类受体激酶、单糖运输通道，以及磷脂运输通道;而下调的蛋白主要包含一些离子运输通道，如H+反向运输通道和Mg2+通道等。利用实验室前期鉴定的5939个在成熟花粉、5945个在萌发花粉中表达的基因信息，我们分析了这899个unique质膜相关蛋白的转录本信息。结果显示58.4％的蛋白（525个）有相应的转录本信息。与水稻根、叶及愈伤组织转录本的表达水平相比，水稻成熟与萌发花粉平均有44％的转录本是优势表达的，而质膜相关蛋白所对应转录本有60％(317/525)是成熟或萌发花粉优势表达的，提示出质膜相关蛋白的基因比其他基因有更强的组织特异性。在525个有转录本信息的质膜相关蛋白中，500个有iTRAQ定量信息（萌发/成熟），比较他们的iTRAQ定量信息及其相应转录本的定量信息发现二者总体上的相关系数为-0.1631，表明质膜相关蛋白基因的转录水平与蛋白丰度之间缺乏相关性。类受体激酶(PRKs)是细胞内外信号转导通路的核心组分，在花粉与柱头的识别、花粉管的极性生长、花粉管在花柱内的导向以及花粉管适时破裂释放精细胞等过程中起重要调控作用。根据保守结构域的比对分析，我们在鉴定的花粉质膜相关蛋白中发现了32个类受体激酶，它们隶属于CrRLK1L、Extensin、LRR、PERK、RLCK、SD、URK以及not_assigned八个亚家族。同时，我们的数据包含了“PRKs-GEF-Rac/Rop”信号转导途径的所有关键蛋白，表明该信号通路在花粉与柱头相互作用以及花粉管极性生长等过程中有重要作用。收起

关键词 : 水稻花粉花粉细胞质膜定量蛋白质组学柱头表面识别极性生长类受体激酶

2. 水稻花粉脂筏的蛋白质组学分析

[学位论文] 韩冰中国科学院研究生院 2011年博士导师: 王台共276页

摘要 : 大部分被子植物的花粉在发育成熟后会进入代谢静止的状态。但当它们在风、动物等媒介的作用下接触到柱头时，能够迅速复水，萌发形成一个极性生长的花粉管，将精细胞准确的输送到胚珠中完成双受精。花粉的萌发以及花粉管的极性生长是研究细胞极性（非... 展开大部分被子植物的花粉在发育成熟后会进入代谢静止的状态。但当它们在风、动物等媒介的作用下接触到柱头时，能够迅速复水，萌发形成一个极性生长的花粉管，将精细胞准确的输送到胚珠中完成双受精。花粉的萌发以及花粉管的极性生长是研究细胞极性（非对称性）建立和维持的重要模型过程，而后者是细胞发育和分化的基础。以往的研究发现Rop等关键分子在细胞膜特定区域定位和活性的调控是启动花粉萌发，维持花粉管极性生长的关键因素，但对其调控机制的了解仍很不完整。有证据显示脂筏可能在非对称的动物和真菌细胞中参与或承担了某些特定蛋白的极性分选过程。然而，由于细胞学研究手段的限制，花粉和花粉管中是否存在脂筏结构仍不清楚。本研究利用脂筏染料filipin对百合花粉管的细胞学观察发现，被filipin染色的富含固醇的膜结构在花粉管质膜上呈不对称分布的特性，集中在花粉管的顶端质膜区。为了研究花粉脂筏蛋白质组的特性，建立了利用细胞粗膜组分(crudemembrane)分离非离子型去污剂抗性膜（DRM）以及利用DRM富集脂筏的技术体系，获得了低密度、富集固醇的花粉DRM和经methyl-β-cyclodextrin处理抽提固醇后的DRM组分。利用非标记定量蛋白组学技术定量比较了这两种DRM组分的蛋白质组，鉴定了1030个蛋白质。通过定量的数据分析从中筛选出245个对methyl-β-cyclodextrin处理敏感的、脂筏相关蛋白。其中既包括flotillin家族蛋白、G蛋白β亚基等脂筏标志蛋白，也包括Rop及其辅助蛋白、lipidsignaling相关蛋白、myosin、胞吐复合体蛋白、网格蛋白依赖型胞吞途径相关蛋白等在花粉管极性生长过程起重要作用的蛋白。这些结果强烈的提示了脂筏在花粉和花粉管中的存在，且可能参与了对Rop、lipidsignaling相关蛋白等关键分子的极性分选和调控。在此基础上，提出了在花粉管中脂筏可能涉及的极性分子分选途径。通过与HeLa细胞和拟南芥悬浮培养细胞相关数据的比较，发现不同物种或不同类型的细胞存在一些保守的、与脂筏结构密切关联的蛋白，如flotillin和fasciclin-likearabinogalactanprotein;同时发现脂筏蛋白组构成亦表现出明显的物种和细胞类型特异性，如水稻花粉脂筏的蛋白组包含适应于花粉管极性生长需求的蛋白。此外，Insilico分析结果显示棕榈酰修饰和肉豆蔻酰修饰可能是调节脂筏蛋白质与脂筏亲和性的重要修饰方式，这种亲和作用可能比磷脂酰肌醇修饰介导的蛋白与脂筏的亲和性更加依赖于脂筏所含的结构固醇。收起

关键词 : 花粉管极性生长细胞膜脂筏蛋白质组学水稻

3. 不同倍性鱼类mtDNA及三倍体湘云鲫Sox基因研究

[学位论文] 郭新红湖南师范大学 2004年博士导师: 刘少军共253页

摘要 : 　　本文通过研究四倍体、三倍体及二倍体mtDNA的分子结构，探讨了这些不同倍性鱼类mtDNA的分子遗传关系及这些不同倍性鱼类与其它相关鱼类的分子遗传关系。用异源四倍体鲫鲤与二倍体日本白鲫交配，大规模制备了生长快、抗逆性强、肉味鲜美的不育三倍... 展开

关键词 : 异源四倍体鲫鲤三倍体湘云鲫线粒体DNA Sox基因

4. 糊粉层特异表达转录因子在水稻籽粒灌浆和萌发中的功能研究

[学位论文] 白爱宁中国科学院大学 2017年博士导师: 刘春明共245页

摘要 : 水稻（Oryza sativa L.）胚乳是人类重要的食物来源之一，它由位于外侧的糊粉层和内部的淀粉胚乳组成，两者均由三倍体的胚乳核发育而来。成熟的水稻颖果中，糊粉层多为单层活细胞，其内累积了大量储藏蛋白、脂肪酸、锌和铁等营养物质，而淀粉胚乳细胞... 展开水稻（Oryza sativa L.）胚乳是人类重要的食物来源之一，它由位于外侧的糊粉层和内部的淀粉胚乳组成，两者均由三倍体的胚乳核发育而来。成熟的水稻颖果中，糊粉层多为单层活细胞，其内累积了大量储藏蛋白、脂肪酸、锌和铁等营养物质，而淀粉胚乳细胞则经历了程序性细胞死亡，并累积了大量淀粉。叶片经光合作用产生的糖类物质以蔗糖的形式由韧皮部运输至水稻颖果后，先经胞间连丝由母本组织运输至糊粉层细胞外侧，而后经定位于糊粉层细胞中的糖转运蛋白运输至发育中的淀粉胚乳细胞内部，但是关于糊粉层中糖类物质的转运调控机制尚不清楚。为挖掘参与调控糊粉层和淀粉胚乳细胞分化和营养物质累积的转录因子，取受精后10～14天的水稻颖果，分离糊粉层和淀粉胚乳细胞进行两个组织的差异表达基因芯片分析。芯片数据显示有949个转录因子在糊粉层和淀粉胚乳差异表达，利用实时定量PCR验证后得到15个转录因子在糊粉层高表达，12个在淀粉胚乳高表达。构建这些转录因子启动子区融合GUS报告基因的载体并转化水稻，GUS染色分析结果显示有2个转录因子在水稻背部糊粉层特异表达，2个在背腹部糊粉层特异表达，3个在糊粉层和胚均有表达，另外，还鉴定到5个在淀粉胚乳中高表达的转录因子。为解析这些基因的功能，分别利用RNA干扰和CRISPR-Cas9技术获得了目的基因表达下调的转基因植物和相应的突变体。通过表型分析，我们发现一个糊粉层特异表达的转录因子OsNF-YB1通过调控蔗糖转运蛋白OsS UT1、OsSUT3和OsSUT4的表达进而调控水稻籽粒灌浆过程。OsNF-YB1基因表达下调的转基因植物和osnfyb1突变体均呈现不同程度的灌浆缺陷，胚乳粉质且淀粉粒显著变小。进一步分析显示osnfyb1颖果中蔗糖转运蛋白OsSUT1、OsSUT3和OsSUT4的表达下调且蔗糖、葡萄糖和果糖含量也显著降低。酵母单杂交、荧光素酶活性实验和电泳迁移率实验证实OsNF-YB1可以直接结合OsSUT1、OsSUT3和OsSUT4基因的5'调控区。以上结果表明，OsNF-YB1通过直接调控蔗糖转运蛋白基因的表达进而调控蔗糖的转运是胚乳发育过程中糖类物质转运调控的一个新的分子机制。糊粉层细胞不仅在糖类物质从母本组织转运至胚乳细胞的过程中发挥着重要作用，而且是α-淀粉酶等水解酶合成的重要场所。在水稻籽粒萌发的过程中，由胚合成并运输至糊粉层的赤霉素可以促进α-淀粉酶基因的表达，α-淀粉酶在糊粉层细胞合成后分泌至淀粉胚乳细胞并将淀粉催化成可代谢的糖类物质，为萌发过程和后期幼苗的生长提供能量。本课题研究过程中发现两个糊粉层和胚均表达的转录因子OsC3H01和OsERF04分别负调控和正调控水稻籽粒萌发过程。OsC3H01表达下调的转基因植物和osc3h01突变体均呈现穗萌发的表型;与之相反，OsERF04表达下调的转基因植物则呈现籽粒萌发推迟的表型。目前为止这两个基因调控水稻籽粒萌发的分子机制尚不清楚，未来的工作中我们将集中解析它们在水稻籽粒萌发过程中的功能，该研究将为解决农作物穗萌发问题提供理论依据。收起

关键词 : 水稻籽粒灌浆籽粒萌发糊粉层基因表达转录因子

5. 文昌鱼免疫相关基因的研究

[学位论文] 张妍山东大学 2012年博士导师: 冯力骏共242页

摘要 : 文昌鱼属于头索动物，是与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。近年来，对文昌鱼的研究越来越受到国际学术界的重视。其研究内容涉及基因组、发育和免疫生物学等不同的领域，进展十分迅速。其中与脊椎动物免疫反应受体多样性相关重要分子的原始形式VC... 展开文昌鱼属于头索动物，是与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。近年来，对文昌鱼的研究越来越受到国际学术界的重视。其研究内容涉及基因组、发育和免疫生物学等不同的领域，进展十分迅速。其中与脊椎动物免疫反应受体多样性相关重要分子的原始形式VCBP(Variableregion-containingchitin-bindingprotein)、与VDJ重排相关基因RAGI、补体系统的主要成员、淋巴样细胞以及免疫细胞凋亡、信号转导、模式识别等关键分子的发现已引起学术界的高度关注;加之佛罗里达文昌鱼基因组的基本完成，使文昌鱼成为研究脊椎动物免疫系统起源与进化以及探讨无脊椎动物和脊椎动物免疫系统演化关系的理想模型。本文旨在通过对文昌鱼中免疫相关基因的研究探索脊椎动物免疫应答系统在进化中的保守性和特异性。本文以青岛文昌鱼和佛罗里达文昌鱼为研究材料，运用生物信息学、免疫学、分子生物学和细胞生物学等研究方法，对文昌鱼中可能参与免疫应答的几个基因进行鉴定和功能研究。特别针对基质金属蛋白酶(MMP)BbMMPL2的的自水解机制及其诱导凋亡的机制进行探索，从而揭示成体文昌鱼利用MMP应对细菌冲击可能的应答方式。另外，我们还探讨了文昌鱼中TGFβ-SMAD信号通路可能在免疫应答中的作用。 MMP主要负责胞外基质(ECM)的降解，从而在细胞的迁移、分化和组织重建等方面发挥作用。但越来越多的研究表明，除了降解ECM，MMP还能利用其自身的水解酶活性激活其他分子，如细胞因子和趋化因子等，从而直接或间接地参与癌症进程、炎症反应或免疫应答等。通过信息学分析筛选，我们最终确定文昌鱼中至少有21种不同的MMP，并按照结构特征将其进行分类、进化分析及功能预测。文昌鱼中的MMP家族成员包括基本型MMP、Ⅰ型跨膜MMP、GPI锚定MMP、分泌型MMP、胶原蛋白酶和基质溶素类MMP，还有很多与脊椎动物MMP并不完全相同的MMP;另外，我们还发现了具有TPR结构域的MMP，这在脊椎动物和无脊椎动物中都是没有的。但是文昌鱼中并未发现明胶型MMP和Ⅱ型跨膜MMP的同源物。文昌鱼中MMP的进化分析表明，MMP的催化域是最原始的结构组分，C端结构域及弗林酶识别位点等都是在进化中的进一步修饰和完善产生的。文昌鱼的MMP大部分属于基本型和膜型MMP，暗示这两类可能是较古老的MMP，是在物种分化(divergence)之前出现的。我们已在成体文昌鱼中成功克隆到的三个MMP家族成员，命名为BbMMPL2、Bf-MMP17和Bf-MMP28，分别属于基本型、膜型和分泌型MMP。这三个基因在成体文昌鱼中广泛分布;大肠杆菌冲击后BbMMPL2转录上调，但对金葡菌的冲击变化不大;Bf-MMP28在金葡冲击后表达上调，但对大肠杆菌应答不明显;而Bf-MMP17在两种菌刺激时转录水平均无变化。这表明BbMMPL2和Bf-MMP28可能在免疫应答中发挥作用，并且对不同性质的细菌应答方式并不相同。我们利用大肠杆菌体系表达了BbMMPL2重组蛋白，并对酶活性进行了鉴定。在蛋白复性过程中我们发现BbMMPL2可以自水解;这种自水解是钙离子依赖的，并且是酶原获得活性所必需的。酶原以分子内和分子间切割的方式进行自水解;水解酶活性可以被金属螯合剂EGTA和MMP广谱阻抑剂GM6001所抑制。点突变E204A也可完全抑制自水解的进程。另外，Met60-Tyr82对酶原快速激活是必须的;BbMMPL2的C端结构域也参与酶原无活性状态的维持;连接域对重组蛋白的复性折叠是必须的。BbMMPL2重组蛋白表达中可通过分子间和分子内二硫键形成二聚物和寡聚体;但并不影响自水解进程。水解终产物可降解明胶、Ⅳ型胶原、酪蛋白和纤维蛋白原，但不能降解纤连蛋白、层粘连蛋白和α1-PI。这些结果表明，文昌鱼中的MMP不仅在一级结构上与脊椎动物和其他无脊椎动物一致，在降解ECM和激活方式上也相似。由于没有可用的文昌鱼细胞系，我们在哺乳动物细胞系中表达了pro-BbMMPL2重组蛋白，并发现该蛋白凝聚分布在细胞质中;而有活性的BbMMPL2重组蛋白在细胞质中均匀分布，并诱导细胞凋亡;点突变使酶失活后细胞凋亡的比例下降。这表明细胞的凋亡是与BbMMPL2的酶活性相关的。有研究表明细胞可通过自杀，即凋亡来减少细菌负担。我们认为，文昌鱼MMP也可通过类似的机制应答细菌冲击。组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)是MMP的内源阻抑剂。MMP与TIMP的平衡是维持正常生命活动所必须的;打破这一平衡将导致与ECM代谢紊乱、炎症、细胞生长和迁移有关的疾病，如关节炎、心血管疾病、癌症、神经紊乱和组织溃烂等。文昌鱼中有两个TIMP同源基因，Bf-TIMP1和Bf-TIMP2b;而在人中TIMP的数量为四个。TIMP在成体文昌鱼的各组织都有表达;Bf-TIMP1在大肠杆菌冲击后表达上调，对金葡菌没有应答;而Bf-TIMP2b的转录在两种细菌冲击过程中均无变化。这说明Bf-TIMP1可能参与了革兰氏阴性菌刺激的免疫应答。我们未能成功在体外表达这两种蛋白。诱导表达过程中大肠杆菌生长异常，因此我们推测可能是TIMP的表达导致大肠杆菌生长被抑制，甚至死亡。我们还对文昌鱼中的TGFβ-SMAD信号通路进行了初步研究。TGFβ-SMAD信号通路是重要的研究生命生长发育的通路。近来有研究指出，该信号通路也参与免疫途径。TGFβ-SMAD信号通路中的组分和传导系统相对其他免疫路径简单得多，如NF-kB信号通路等，只需要配体-受体相互作用、磷酸化激活、转入细胞核等就可调控靶基因的转录。较少的组分参与使得该信号通路成为我们选择进行免疫应答研究平台的首选。利用生物信息学手段我们在文昌鱼中分别找到了TGFβ、TGFβ受体、R-Smad和Co-Smad这些构成TGFβ-SMAD信号通路所必须的组分的同源基因。我们还找到了I-Smad及该通路中的辅助转录因子的同源物。在对这些同源物进行进化分析时我们发现，文昌鱼中的这些蛋白相对简单，并没有异构体的分化。如只有一个TGFβ和R-Smad;而在脊椎动物的该通路中通常具有1-3个TGFβ和2个R-Smad（Smad2和Smad3），分工更细。这些都说明文昌鱼中具有完整并保守的TGFβ-SMAD信号通路。我们对这些基因进行了分离，并发现细菌冲击后Bf-TGFβ、Bf-TβRⅠ、Bf-Smad2、Bf-Smad4、Bf-Smad6和co-factorBf-SnoN基因转录都有不同程度的上调，只有TβRⅡ变化不大。这说明TGFβ-SMAD信号通路很可能参与了免疫应答。另外，为了研究该通路的作用机制，我们筛选了几个下游靶基因并进行了检测。其中iNOS基因在免疫冲击后转录增加，2h后转录开始下调。我们推测Bf-iNOS基因可能是受到TGFβ-SMAD信号通路的抑制:但具体的作用机制还需要我们未来更细致的体内实验进行证明。为此，我们还在体外表达了各媒介物的重组蛋白，为将来首先在体外检测受体-配体、Smad与co-factor之间的相互作用及制备抗体奠定基础。通过本文的研究，我们第一次对文昌鱼中的MMP家族成员进行了分类，首次鉴定了BbMMPL2的生化性质并提出其可能诱导细胞凋亡的机制。BbMMPL2自水解机制的研究为其可能参与免疫应答的方式提供参考。我们还第一次提出文昌鱼中存在简单并保守的TGFβ-SMAD信号通路，并且该通路可能也参与细菌冲击的免疫应答。通过我们的研究，希望阐述文昌鱼中可能存在的免疫应答模式及在演化中的保守性和特异性。收起

关键词 : 文昌鱼免疫应答基质金属蛋白酶组织金属蛋白酶阻抑剂 TGF&beta -SMAD信号通路

6. 人孤雄单倍体胚胎干细胞的建立与应用

[学位论文] 张晓宇中国科学院大学 2021年博士导师: 李劲松共240页

摘要 : 单倍体胚胎干细胞(haploidembryonicstemcells，haESCs)是从含有卵子或精子核遗传物质的单倍体囊胚中建立的胚胎干细胞系（分别称为孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞）。孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞可以结合CRISPR-Cas9基因编辑技术实现细胞水平的大规模遗... 展开单倍体胚胎干细胞(haploidembryonicstemcells，haESCs)是从含有卵子或精子核遗传物质的单倍体囊胚中建立的胚胎干细胞系（分别称为孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞）。孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞可以结合CRISPR-Cas9基因编辑技术实现细胞水平的大规模遗传筛选，为哺乳动物的功能基因研究提供新的手段。另外，孤雄单倍体胚胎干细胞还可以作为精子的替代物通过卵子注射产生健康半克隆小鼠（又被称为类精子干细胞），其结合CRISPR-Cas9技术可以开展个体水平的遗传筛选研究。到目前为止，啮齿类小鼠和大鼠，灵长类食蟹猴、恒河猴和人类的孤雌单倍体胚胎干细胞均已成功建立，而孤雄单倍体胚胎干细胞只在小鼠和大鼠中成功建立，因此，灵长类动物的精子是否可被重编程成为孤雄单倍体胚胎干细胞是重要科学问题。通过改良的基于受精胚胎前原核去核法构建人的精子核移植胚胎，结合优化的人胚胎干细胞低氧环境建系方法，成功建立了两株只携带精子遗传物质的人孤雄单倍体胚胎干细胞系(HumanandrogenetichaESCs，hAG-haESCs)。单倍体细胞会自发二倍体化，hAG-haESCs可通过定期流式细胞分选(FluorescenceActivatedCellSorting，FACS)富集单倍体细胞的方法长期稳定维持单倍体核型;另外，通过比较不同的培养体系发现，我们采用的KSR/bFGF培养体系和MEF（mouseembryonicfibroblasts）饲养层细胞是稳定维持单倍体特性的两个重要因素;该细胞具有体内体外三胚层分化能力，并且在分化过程中，具有非常稳定的单倍体维持能力。进一步，围绕hAG-haESCs开展了三方面的应用研究。第一，结合全基因组甲基化测序技术(WholeGenomeBisulfiteSequencing，WGBS)和转录组测序技术(RNAsequencing，RNA-seq)，我们发现hAG-haESCs和人孤雌单倍体胚胎干细胞(hPG-haESCs)可以维持广泛的印迹基因的甲基化修饰特征和亲本特征的转录本表达模式，进而通过比较hAG-haESCs和hPG-haESCs的转录组和DNA甲基化修饰的特征发现一系列潜在的新的印记基因。第二，单倍体细胞二倍体化后形成了携带两条X染色体的二倍体细胞，为开展X染色体失活调控机制提供了新的手段。我们系统分析了二倍体化来源的人孤雄二倍体胚胎干细胞X染色体状态，发现单倍体二倍体化得到的人孤雄胚胎干细胞呈现两条X染色体都活化、XIST基因启动子到第一个外显子范围内的CpG岛高甲基化、且不表达XIST的状态;而这些细胞在体内形成的畸胎瘤中分化的体细胞建立了一条X染色体活化而另一条X染色体失活的典型体细胞X染色体失活的状态。第三，我们建立了人卵子胞浆内单倍体胚胎干细胞注射技术，发现hAG-haESCs可以替代精子使卵子“授精”，并在体外发育到囊胚。进一步对重构囊胚开展了单细胞转录组测序（singlecellRNAsequencing，sc-RNAseq）研究，发现其与正常受精来源囊胚高度相似。最后，我们从重构囊胚中建立二倍体胚胎干细胞系，发现这些细胞具有正常胚胎干细胞相似的特征。这些研究首次证明了灵长类（人类）精子可以被成功重编程成为可体外长期培养的单倍体胚胎干细胞，建立了基于人类精子干细胞的半克隆技术，为人类早期胚胎发育研究提供了新工具。收起

关键词 : 人孤雄单倍体胚胎干细胞精子核移植受精胚胎前原核去核法单倍体核型

7. 水稻湿度敏感型雄性不育基因OsUGT的图位克隆及功能分析

[学位论文] 周媛中国科学院大学 2018年博士导师: 漆小泉共231页

摘要 : 花粉包被又被称为含油层或花粉鞘，其主要成分包含脂肪酸、类脂质蛋白、黄酮类物质和类异戊二烯类物质以及其它一些未知化合物。花粉包被位于花粉粒最表层，它不仅能够保护雄配子免受高温、紫外、干燥和微生物侵染等外界恶劣环境因子的影响，还能在传... 展开花粉包被又被称为含油层或花粉鞘，其主要成分包含脂肪酸、类脂质蛋白、黄酮类物质和类异戊二烯类物质以及其它一些未知化合物。花粉包被位于花粉粒最表层，它不仅能够保护雄配子免受高温、紫外、干燥和微生物侵染等外界恶劣环境因子的影响，还能在传粉授精过程中发挥重要作用，如它可以防止花粉自身水分散失、维持花粉活性以及影响花粉与柱头相互识别。花粉包被含量和组成成分异常，会导致某些植物出现条件敏感型雄性不育。例如，拟南芥蜡质缺失突变体cer1、cer2、cer3、cer6和cer8的花粉包被中脂肪酸成分异常，均表现为湿度敏感型雄性不育。因此，对花粉包被的形成过程、组成成分和功能进行研究，不仅具有重要理论意义，而且能指导条件敏感型雄性不育材料的创制，具有潜在应用价值。本实验室前期研究发现水稻2，3-氧化鲨烯环化酶基因OsOSC12的功能缺失突变体E157具有湿度敏感型雄性不育特性，该突变体花粉包被中棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)和亚麻酸(C18∶3)含量显著下降，引起花粉粒失水速率过快，进而导致湿度敏感型雄性不育。本研究的目的是深入解析水稻湿度敏感型雄性不育的分子机制。主要手段是筛选新的湿度敏感型雄性不育突变体，克隆新的湿度敏感型雄性不育基因，并对基因功能进行分析。通过在水稻开花期对稻穗进行套袋保湿，筛选到一个新的湿度敏感型不育突变体S4410。自然条件（RH＜60％）下，S4410的成熟花粉粒在散粉后快速失水干瘪且不能与柱头发生粘附，导致结实率不到10％;然而，其柱头能够接收野生型的花粉粒并使之正常粘附和萌发，表明它属于雄性不育，且雌配子体发育正常;高湿条件(RH＞80％)下，S4410的花粉粒恢复对柱头的粘附，结实率也恢复到80％以上，表明该突变体属于湿度敏感型雄性不育。透射电镜分析发现S4410的花粉包被成分缺失。此外，气相色谱和质谱联用仪(GC-MS)定量分析结果显示，S4410的花粉包被中棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸含量显著下降，由此推测，该突变体花粉包被中这三种脂肪酸的含量变化与湿度敏感型雄性不育特性相关。图位克隆分析发现，控制S4410湿度敏感型雄性不育的基因位于3号染色体上约80Kb范围内，该区段包含14个基因。其中，仅Os03g11350在花药中特异高表达，S4410中该基因编码的蛋白质在第307位由甘氨酸突变为天冬氨酸。Os03g11350被注释为UDP-糖基转移酶，属于UDP-糖基转移酶超家族73D亚家族。CRISPR/Cas9突变体分析和转基因互补实验验证了OsUGT是引起S4410产生湿度敏感型雄性不育的基因。转录组和RT-PCR分析均表明OsUGT基因在第8-9期花药中高表达;Western blot分析发现，OsUGT蛋白在第9-10期花药中高表达;mRNA原位杂交、GUS染色和绿色荧光蛋白融合表达分析均显示OsUGT在花药绒毡层细胞、花药腔和小孢子表面特异表达，推测其可能是在第9期花药的绒毡层细胞中大量合成，随后向花药腔和小孢子表面逐渐扩散。非靶向代谢组学分析鉴定到9个化合物在突变体S4410中积累，体外酶催化实验发现其中5个能与OsUGT发生反应，暗示它们极有可能是OsUGT在植物体内的催化底物。GC-MS检测结果表明，突变体S4410和野生型中花11号的花药中棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸和三萜酯的含量相当，S4410的花粉包被中却完全检测不到上述脂肪酸和三萜酯，由此推测，OsUGT可能影响它们从绒毡层细胞向花粉包被运输。不同发育时期花药的透射电镜分析显示:突变体S4410和E157绒毡层细胞的质体小球和脂质体形成和降解异常，导致脂类物质不能正常进入花粉外壁的空腔中形成花粉包被。本研究还筛选到其它6个湿度敏感型雄性不育突变体，其中2个为OsUGT的等位突变，另外4个受未知基因控制。综上所述，本研究发现了突变体S4410的湿度敏感型雄性不育性状受糖基转移酶OsUGT控制，并与花粉包被中棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸的含量变化显著相关。OsUGT在花药绒毡层细胞、花药腔和小孢子表面特异高表达，可能参与脂肪酸和三萜酯等脂类物质的糖基化修饰，促进它们从绒毡层细胞运输至花粉包被。本研究为深入解析花粉包被形成和湿度敏感型雄性不育的分子机制奠定了基础;同时为两系法杂交育种提供了更多不育材料。收起

关键词 : 水稻湿度敏感型雄性不育花粉包被图位克隆功能鉴定

8. 蜕膜自然杀伤性细胞（dNK）在早期妊娠维持中的作用机制研究

[学位论文] 马立阳中国科学院大学 2017年博士导师: 王雁玲共230页

摘要 : 妊娠过程中，母胎界面微环境中存在大量的免疫细胞，与子宫蜕膜、滋养层细胞、子宫血管等发生复杂的互作，建立免疫豁免并维持妊娠。妊娠早期，蜕膜自然杀伤细胞(dNK)占母胎界面淋巴细胞总数的70％左右;与外周血NK细胞不同，dNK细胞标记为CD56brightC... 展开妊娠过程中，母胎界面微环境中存在大量的免疫细胞，与子宫蜕膜、滋养层细胞、子宫血管等发生复杂的互作，建立免疫豁免并维持妊娠。妊娠早期，蜕膜自然杀伤细胞(dNK)占母胎界面淋巴细胞总数的70％左右;与外周血NK细胞不同，dNK细胞标记为CD56brightCD16-CD3-，其细胞杀伤性减弱，而细胞分泌功能却很强大。已有研究显示dNK细胞能够通过产生细胞因子和趋化因子诱导滋养层细胞的迁移和分化，还可通过其表面KIR受体与滋养层细胞的HLA配体相互识别，抑制免疫排斥反应。dNK细胞功能异常与复发性流产、子痫前期等多种妊娠疾病的发生发展密切相关。有关人dNK细胞功能的认识大都来源于临床样本分析和体外模型的研究，难以模拟母胎界面上多细胞互作的复杂微环境;而小鼠和人子宫蜕膜NK细胞的分子标记、分布特性等差异较大，小鼠研究得到的结果仍然难以帮助我们精确地认识人类dNK细胞的功能。基于此，本研究借助比较正常妊娠和复发性流产情况下蜕膜NK细胞(dNK)功能差异，并构建人源化dNK小鼠模型，深入探讨dNK在胎盘发育和早期妊娠维持中的作用机制。分别从妊娠6-10周非病理因素人工流产(NOR)和复发性流产(RSA)患者的子宫蜕膜组织中分离纯化CD56+CD16-CD3-CD9+标记的dNK细胞，发现RSA-dNK细胞中杀伤性分子TNF-α、IFN-γ、CD107a阳性细胞的比例增加，特异性杀伤靶细胞K562能力增强;RNA-seq筛选到RSA-dNK细胞差异表达的376个基因、139个已知LncRNA和5个未知LncRNA;炎症细胞因子抗体芯片筛查结果表明RSA-dNK细胞中多种炎性因子的合成与NOR-dNK细胞有显著差异。在CBA/J X DBA/2J自发流产小鼠模型中，未吸收胚胎表现为明显的胎儿生长受限，蜕膜NK细胞数量减少，分布异常;胎盘滋养层细胞侵润相对浅表，迷路层胎儿血管发育不完善，母体血流灌注减少。人类复发性流产和小鼠自发流产模型的结果表明子宫NK细胞功能异常与胎儿朋台盘发育受损有密切关联。我们将人dNK细胞于妊娠早期(E6.5)过继回输到免疫缺陷NOG孕鼠中，流式细胞术检测证明dNK细胞能够归巢富集到小鼠子宫和蜕膜中;与不回输细胞的对照组（PBS组）相比，正常妊娠dNK细胞回输(NOR组)可使NOG小鼠的流产率从14.89％降至0％，而复发性流产dNK细胞回输（RSA组）NOG小鼠，流产率增高至26.89％。由此建立了功能性dNK的人源化NOG小鼠模型。对该模型中未吸收胚的胎盘结构分析显示，与PBS组相比，NOR组胎盘中滋养层细胞向蜕膜侵润迁移能力增强，侵润相关基因(prl3b1，prl3d1，prl2c2等)表达水平上升;胎盘迷路层胎儿血管分支完善，胎儿血管面积和母体血窦面积均显著增大，合体化相关分子（Syna，mct1, mct4等）表达增强;而复发性流产dNK细胞的过继回输则阻碍了NOG小鼠胎盘发育，表现为滋养层细胞侵润能力下降，迷路层胎儿血管分支不完善，胎儿血管和母体血窦面积减小，侵润和合体化相关基因表达异常等。进而利用小鼠滋养层干细胞(mTS)体外诱导分化模型，证明正常妊娠dNK细胞条件培养基能够有效地促进mTS细胞向侵润方向和合体化方向分化，而复发性流产dNK细胞对mTS分化的作用则显著削弱。进一步地，我们鉴定到一个新的dNK细胞亚群，即CD3-CD56+CD16-CD9+CXCR4+（简称CD56+CXCR4+）dNK细胞，功能分析证明CD56+CXCR4+细胞较CD56+CXCR4-细胞有更强的细胞因子分泌能力和更低的细胞杀伤活性。在复发性流产蜕膜组织中CD56+CXCR4+dNK细胞的比例明显的降低。当我们将正常蜕膜来源的CD56+CXCR4+dNK细胞添加到复发性流产蜕膜dNK细胞中，使之比例从10％增加到正常情况下的30％，然后将其回输到NOG孕鼠中，发现复发性流产dNK细胞导致的NOG小鼠的高流产率得到显著降低，胎盘滋养层细胞分化和胎儿发育状况得到明显改善。由此证明CD56+CXCR4+dNK细胞是一群有利于妊娠维持的dNK细胞。综上所述，本研究结合人类复发性流产蜕膜组织、dNK细胞体外培养模型、NOG免疫缺陷小鼠模型、mTS体外分化模型等，证明母胎界面微环境可影响dNK细胞的基因表达和功能，而dNK细胞可参与调节滋养层细胞向不同途径的分化，影响胎盘发育和胎儿生长。鉴定到新的CD56+CXCR4+dNK细胞，证明这群细胞是促进滋养层细胞分化、维持妊娠的重要dNK亚群。本研究的结果为深入阐释dNK细胞在早期妊娠维持中的作用提供了新的思路，并为发展复发性流产的新型干预策略提供了科学证据。收起

关键词 : 复发性流产蜕膜自然杀伤性细胞功能差异胎盘发育早期妊娠维持

9. 水稻化感物质的鉴定和作用机制研究

[学位论文] 马爱民中国科学院大学 2020年博士导师: 漆小泉共225页

摘要 : 水稻是世界上种植面积最大的作物之一，是全球一半以上人口所赖以生存的粮食作物。随着人口的急剧增长，提高水稻产量已成为育种者和研究人员的主要目标。草害是制约水稻优质高产的重要因素之一，目前施用除草剂是稻田控草的主要手段，该方法虽然在水... 展开水稻是世界上种植面积最大的作物之一，是全球一半以上人口所赖以生存的粮食作物。随着人口的急剧增长，提高水稻产量已成为育种者和研究人员的主要目标。草害是制约水稻优质高产的重要因素之一，目前施用除草剂是稻田控草的主要手段，该方法虽然在水稻稳产方面起到了一定的作用，但长期施用除草剂会引起除草剂残留、抗除草剂型杂草数量增加以及环境污染等问题。因此，利用植物化感作用控草的策略越来越受到重视。对水稻化感作用代谢基础和遗传机制的研究将为水稻化感作用的应用、绿色农药的开发及具有化感能力的优质水稻品种的培育奠定基础。本论文以包含203个品种的水稻Mini-Core自然群体为研究材料，连续两年观察了该群体各个品种的化感能力，发现大多数aus和籼稻品种的化感能力强于粳稻品种。然而，以水稻化感能力为表型进行全基因组关联分析并未获得显著关联的遗传位点，意味着水稻化感能力表型可能是由多基因控制的复杂性状，因此利用较小的遗传群体进行关联分析难以获得关联位点。为此本研究提出了利用相关分析将化感表型分解为与其相关的化感物质含量变化，以此为基础探究水稻化感作用的遗传机制。通过分析获得了8个与水稻化感能力表型显著相关的代谢物，这些代谢物均在aus或籼稻品种中含量较高。以代谢物含量为表型进行全基因组关联分析发现，与水稻化感能力相关的8个化合物中，化合物C2685和C3888遗传位点的效应值较高，QTL位点分别位于水稻第2号和第7号染色体。进一步通过结构鉴定发现化合物C2685为荭草苷(orientin)，化合物C3888为麦黄酮-5-O-葡萄糖苷(tricin-5-O-glucopyranoside)，二者均为黄酮苷类物质。通过创制候选基因功能缺失突变体或过表达材料发现糖基转移酶基因UGT4(LOC_Os07g32060)是引起化合物C3888含量变化的关键基因，而糖基转移酶基因UGT5（LOC_Os02g37690）与化合物C2685的含量变化有关。体外酶活分析表明UGT4在催化麦黄酮(tricin)形成C3888的过程中发挥着重要作用;UGT5能以化合物C2685为底物，生成另一种糖基化产物。化合物C2685和C3888分布于水稻叶片表面，通过叶片淋洗的方式释放到环境中。与目前报道的水稻中主要的黄酮类化感物质麦黄酮(tricin)相比，化合物C2685和C3888对杂草种子胚根生长的抑制作用更为明显。外施化合物C2685和C3888引起稗草种子胚根中GST基因和过氧化物酶类基因表达量发生显著改变，进一步分析发现化合物C2685和C3888可能是通过降低杂草的“解毒”功能以及增加杂草种子胚根中活性氧含量来影响其生长的。 UGT4和UGT5突变体或过表达材料中基因表达量的改变会引起化合物C2685和C3888含量的改变，而且转基因材料叶片水洗物对杂草生长的抑制作用也发生显著改变，说明UGT4和UGT5基因可能通过调控相应化合物的含量来改变水稻的化感能力。稻属中基因多样性分析发现UGT4基因在某些籼稻和野生稻中存在两个拷贝，而在粳稻中只存在一个拷贝;UGT5蛋白功能在某些aus、籼稻和野生稻中缺失，意味着某些aus和籼稻品种可能通过增加UGT4基因的拷贝数来增加化合物C3888的含量，通过抑制UGT5的功能使化合物C2685积累，最终导致某些aus和籼稻品种中化感物质含量高，化感能力强。综上所述，本研究通过将化感表型分解为与其相关的化感物质，利用遗传代谢组学方法探究了黄酮苷代谢途径在水稻化感中的作用，为利用较小的遗传群体解析复杂农艺性状的遗传机制及代谢基础提供了新思路。本研究发现了两种与水稻化感作用显著相关的黄酮苷类物质C2685和C3888，丰富了水稻中具有化感作用的黄酮类物质种类，为水稻化感作用的应用及绿色农药的开发奠定了基础。本研究进一步揭示了参与化合物C3888和C2685代谢途径的关键基因UGT4和UGT5在水稻化感中的重要作用，为培育具有较强化感能力的优质水稻品种提供了理论指导。收起

关键词 : 水稻化感作用代谢组学黄酮苷类物质

10. 孤雄单倍体胚胎干细胞和基因编辑技术在小鼠胚胎和原始生殖细胞发育研究中的应用

[学位论文] 李庆中国科学院大学 2020年博士导师: 李劲松共222页

摘要 : 发育生物学两个非常重要的事件即:胚胎和原始生殖细胞的发育，二者均伴随着剧烈的表观遗传重编程，同时众多关键的基因和调控区域在这过程中扮演着重要的角色，具有不同的时空调控谱。由于技术的限制，一些重要的功能元件和修饰在发育过程中的作用并没... 展开发育生物学两个非常重要的事件即:胚胎和原始生殖细胞的发育，二者均伴随着剧烈的表观遗传重编程，同时众多关键的基因和调控区域在这过程中扮演着重要的角色，具有不同的时空调控谱。由于技术的限制，一些重要的功能元件和修饰在发育过程中的作用并没有被详细地研究，包括印记调控区、功能基因、DNA甲基化、组蛋白的修饰、RNA的甲基化等。博士期间，我主要的工作是利用半克隆技术和基因编辑技术揭示了印记调控区域(H19-DMR和IG-DMR)和DNA甲基化在胚胎发育过程中的作用，以及重要的功能基因（Trim37和Dnd1）在原始生殖细胞发育中的功能。 2012年，我们实验室首次建立了小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞(Androgenetic haploid embryonic stem cells，AG-haESCs),同时证明这些细胞通过卵胞质注射，能够代替精子使卵母细胞“受精”产生健康的半克隆小鼠。因此，这些细胞被称为“人造精子细胞”，整个技术路线被称为半克隆技术。然而，半克隆胚胎的发育率低。进一步研究发现，AG-haESCs中H19-DMR和IG-DMR(Differential DNA methylation region)的甲基化丢失严重，同时，发育异常的半克隆胚胎也存在H19-DMR和IG-DMR的甲基化丢失;通过删除AG-haESCs的H19-DMR和IG-DMR模拟该区域的甲基化状态，使得半克隆小鼠的出生效率提高了10倍。H19-DMR和IG-DMR是最早发现的父本基因组上的差异甲基化区域，调控这两个印记区域中H19，Igf2，Gtl2，Dlk1，Dio3等印记基因的表达。大量研究显示H19-DMR和IG-DMR在胚胎发育中起到重要的作用，但是，二者是如何协同调控胚胎的发育却一直没有被阐释。我们利用“人造精子细胞”介导的半克隆技术首次揭示父源印记调控区域(H19-DMR和IG-DMR)在胚胎发育过程中的时序调控作用;通过形态学和转录组分析，发现这两个DMR对着床前胚胎发育无明显调控作用;其中H19-DMR在妊娠的中期通过调控胎盘的发育，对胚胎正常发育具有关键调控作用;IG-DMR在妊娠的后期通过调控一系列印记基因（包括Dlk1，Gtl2，Dio3等）的正常表达，对胚胎的存活具有重要作用;进一步在缺失H19-13kb(包括H19和H19-DMR)的AG-haESCs中敲除IG-DMR，获得的TKO-AG-haESCs具有更好地支持半克隆小鼠发育和出生的能力。该研究显示“人造精子细胞”介导的半克隆技术是研究胚胎发育印记调控的有效工具。 “人造精子细胞”易于在体外进行基因编辑，结合CRISPR-Cas9技术可以一步获得基因纯和敲除的个体，实现个体水平的遗传筛选。首先，我们通过优化CAS9蛋白在“人造精子细胞”中的表达系统，显著提升了获取基因纯和敲除小鼠的效率。原始生殖细胞(Primordial germ cell，PGC)发育是我们一直关心的重要科学问题，我们利用优化的个体水平筛选系统去寻找对PGC发育重要的基因。通过对野生型E9.5PGC的RNA-seq数据的分析，我们选择了其中高表达的E3泛素连接酶TRIM家族的33个基因进行个体水平的遗传筛选。筛选结果显示Trim37对于小鼠PGC的发育至关重要，因此，我们通过受精卵注射CRISPR-Cas9建立了2个Trim37敲除的小鼠模型，发现它们的PGCs在E9.5显著减少，E12.5PGCs基本完全缺失，成年的雌雄个体均完全缺失生殖细胞。进一步，通过单细胞的RNA-seq分析E9.5PGC的表达谱，发现Trim37突变的小鼠PGC的命运倾向于由生殖细胞向体细胞转变。同时，我们发现Trim37敲除后并没有伴随PGC凋亡信号的增加，暗示着Trim37是通过改变细胞命运导致PGC数目改变。我们进一步构建了Trim37在PGCs中条件性敲除的小鼠模型（Blimp1-cre介导），得到了相同的PGCs完全缺失的表型，证明了TRIM37是通过影响PGCs本身发育从而影响其迁移和增殖的过程。进一步，我们通过构建TRIM37蛋白酶活位点突变的小鼠模型，证明了E3泛素连接酶的活性对PGC发育的重要作用。相关研究表明，该基因的突变会导致人类Mulibrey nanism疾病（肌肝脑眼侏儒）和不孕不育的发生。我们发现携带人类遗传病中Trim37突变位点的小鼠模型也显示PGC发育失败，暗示TRIM37在人类生殖细胞发育过程中的重要作用。 “人造精子细胞”介导的半克隆技术结合CRISPR-Cas9技术可以进行个体水平功能基因的遗传筛选。2016年David R.Liu课题组建立了基于CRISPR-Cas9技术的高效诱导基因组单一核苷酸突变的胞嘧啶碱基编辑器(BE3)，可以在不产生DNA双链断裂的情况下，将靶位点C/G转变为T/A。我们推测，将碱基编辑技术和半克隆技术结合起来，可进行个体水平功能氨基酸位点的遗传筛选。首先，我们在小鼠ESCs中，通过将BE3蛋白质的氨基端和羧基端分别加上一个核定位序列，建立了高效的单碱基编辑系统。随后，我们将该系统应用于小鼠“人造精子细胞”上，发现优化的BE3不仅可以在“人造精子细胞”上实现高效的单碱基编辑，将携带BE3的“人造精子细胞”注入卵子还可以高效地产生纯合点突变的半克隆小鼠。进一步，我们向“人造精子细胞”中导入一个针对小鼠PGC发育密切相关的Dnd1基因不同核苷酸位点的sgRNA慢病毒文库（含77个sgRNAs），发现能在半克隆胚胎中高效地诱导不同位点的单碱基突变。通过两轮的遗传筛选，我们发现并验证了DND1的E59K、V60M、P76L和G82R对PGC的发育具有重要作用。最后，通过对蛋白质结构的预测、突变后蛋白的稳定性、蛋白质与蛋白质相互作用等多个层次分析发现这些位点对于DND1蛋白质稳定性和其与其它蛋白质的相互作用起着关键作用。 BE3系统通过受精卵注射，可以对靶位点进行碱基突变产生提前终止子，从而实现靶基因的敲除。因此，我们推测利用该策略可以在胚胎早期实现多基因的同时敲除。为此，我们首先建立了植入前胚胎中测定编辑效率的筛选系统，发现hA3A-eBE-Y130F编辑器具有最高效的编辑效率和最低的脱靶效应。同时，为了便于快速地设计碱基编辑的sgRNA，我们建立了Base-avenger的网站。基于此，我们建立了Multi-Stop的编辑系统，可以快速对多个基因进行同时敲除。首先，我们对TET家族的Tet1/2/3侣进行同时敲除，发现合子时期TET蛋白质的缺失导致胚胎发育阻滞在E9.5。同时，我们发现Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO的胚胎原肠运动正常发生，发育阻滞在E8.5;而Dnmt1/3a/3b-TKO的胚胎发育阻滞在E7.5的原肠运动时期，这些结果与通过生殖细胞介导（Zp3-cre和Stra8-cre）的Dnmt1/3a/3b-TKO胚胎表型相同，证明Multi-Stop的编辑系统的可靠性。进一步，我门在Dnmt1-KO，Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt1/3a/3b-TKO的基础上同时敲除Tet1/2/3，发现表型未发生明显改变。这些结果暗示，维持DNA甲基化的DNMT1和起始性DNA甲基化的DNMT3A/3B共同维持着小鼠原肠运动的发生，同时不依赖于TET家族蛋白。收起

关键词 : 胚胎发育原始生殖细胞人造精子细胞半克隆技术基因编辑原肠运动