摘要: 癌症是困扰人类几代人的恶性疾病，继续作为一个普遍的公共卫生问题在全球范围内持续存在。分子生物学的显著进步促使核酸纳米材料在生物传感器、细胞成像和药物输送等多个领域的应用取得重大进展，从而促进了基础医学研究。DNA 的高度可编程性为分子... 展开 癌症是困扰人类几代人的恶性疾病，继续作为一个普遍的公共卫生问题在全球范围内持续存在。分子生物学的显著进步促使核酸纳米材料在生物传感器、细胞成像和药物输送等多个领域的应用取得重大进展，从而促进了基础医学研究。DNA 的高度可编程性为分子生物学研究提供了多种可能，并可以精确控制纳米材料的尺寸、形状和功能。然而，在利用DNA纳米技术创造生物产品之前，必须克服各种各样的障碍。例如，传统的等温扩增技术已经在生物传感中得到了广泛的应用。然而，它的信号放大完全依赖于蛋白酶，而且它的活性在生理环境中受到限制。DNA 纳米载体作为药物递送系统的部署受到多种因素的严重制约，如核酸酶降解、细胞摄取不良、免疫细胞检测和降解以及不确定的生物分布特征。本文中，我们主要是通过使用一维 DNA纳米线来解决 DNA纳米技术应用于诊断和治疗的瓶颈问题。通过对纳米线的功能化设计，我们试图提高DNA纳米技术在临床应用中的实用性。 第一章 基于 RCA 反应的三发卡自反馈系统用于细胞内 microRNA成像以及检测 目的： 本章旨在对传统的 RCA反应产生的 DNA纳米线进行功能化设计，从而开发一种高灵敏、高特异性的生物传感器用于检测癌症标志物miR-21并在细胞中实现可视化 方法： （1）利用传统的RCA反应产生的DNA纳米线进行功能化设计，从而使三种不同的DNA发夹结构能够进行催化反应，从而设计出基于滚动循环扩增的三发夹介导的反馈系统（THF-RCA）。 （2）通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和荧光采集验证THF-RCA传感器的可行性。 （3）通过荧光采集优化THF-RCA传感器并探究其检测性能。 （4）使用激光共聚焦显微镜对 THF-RCA 传感器在细胞成像中的可行性和性能进行考察。 结果： （1）相对传统的 RCA 反应，基于滚动循环扩增的三发夹介导的反馈系统（THF-RCA）大大增强了对miR-21的检测能力； （2）THF-RCA传感器的检测范围达到5个数量级，检测限低至1 fM，线性相关系数达0.99以上，具有高灵敏度和良好的相关性。 （3）THF-RCA 传感器具有优异的特异性和单碱基突变鉴别能力，能够很好的区分其他 miRNA 以及碱基突变的 miRNA-21。 （4）THF-RCA传感器允许体外检测miRNA而不需要逆转录。 （5）THF-RCA传感器能够用于miR-21的原位成像，与miRNA-FISH技术相比，miRNA的细胞内成像具有更高的灵敏度。 第二章 回文介导的一步法自组装多价 DNA 纳米线用于癌细胞的识别与治疗 目的： 本章旨在利用回文结构的优势，以碱基互补配对为原则，从而开发一种具有靶向能力的新型DNA纳米线（BMNW）并用于装载药物Dox，从而实现癌细胞的靶向杀伤。 方法： （1）BMNW-Apt的构建及表征：根据方案设计三条单链DNA（ssDNA），通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术验证探针组装、比例优化以及稳定性，并通过原子力显微镜表征BMNW-Apt的形貌； （2）Sgc8 适配体的引入可以使 BMNW-Apt识别靶细胞表面的 PTK7 蛋白。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术探究BMNW-Apt的靶向性、内吞途径及亚细胞定位； （3）通过荧光分光光度计记录 Dox 的荧光光谱，并探讨载体 BMNW-Apt的药物装载和药物释放的能力； （4）通过激光共聚焦显微镜实时监控 BMNW-Apt@Dox在细胞内的药物释放过程； （5）通过 CCK8和流式细胞凋亡试剂盒评估细胞存活率，并验证 BMNW-Apt@Dox的选择性杀伤靶细胞的能力。 结果： （1）本章设计了一种新型的DNA纳米线，称为生物启发的多价DNA纳米线（Bioinspired Multivalent DNA Nanowires，BMNW）。BMNW的特点在于H1和H3序列的5''端都有一个回文结构，使得基本单元可以交替结合，形成一个长的周期性有序的DNA纳米线骨架。 （2）H2-Apt以直立和规则的方式排列适配体，与BMNW结合，形成周期性多价适配体壳层，以此构建BMNW-Apt。 （2）BMNW-Apt 表面的核酸适配体不仅增加了纳米材料的抗降解能力，而且使目标纳米线能够特异性地识别CCRF-CEM细胞和HeLa细胞。 （3）BMNW-Apt 通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞，然后定位于溶酶体，并在6小时后实现溶酶体逃逸。 （4）BMNW-Apt还可以携带化疗药物Dox，并能够在体内外实现药物的释放，实现细胞的选择性杀伤。 结论： （1）本文中，通过功能化DNA纳米线，设计出THF-RCA生物传感系统和药物载体BMNW-Apt，解决了DNA纳米结构在细胞应用领域的易核酸酶降解、细胞摄取不佳、免疫细胞检测和降解以及不确定的生物分布特征等问题。 （2）THF-RCA生物传感器表现出令人印象深刻的检测miR-21的能力，其目标miRNA可以从突变版本和无目标的 miRNA中清楚地识别出来。此外，传感器能够与金标准RT-PCR相比，操作简单，无需体外逆转录，亦可实现体外检测miRNA；与miRNA-FISH技术相比，其在细胞内成像中具有更高的灵敏度。这种THF-RCA扩增策略能够提高基于 RCA策略的性能，并为生物研究、临床诊断和疾病治疗进展跟踪提供新的扩增系统。 （3）载体 BMNW-Apt 表面的核酸适配体保护层不仅增加了抗降解能力，而且使BMNW-Apt能够特异性地识别PTK7高表达的肿瘤细胞。除了靶向性这一令人印象深刻的能力外，BMNW-Apt 还可以携带化疗药物 Dox，发挥靶向治疗作用，规避传统化疗药物的毒副作用。这种新型的纳米线BMNW-Apt不仅设计简单，组装便捷，而且表现出高效的靶向能力和抗降解能力，展现出DNA纳米线作为优秀药物载体并实现肿瘤靶向治疗的巨大潜力。 收起