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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 背景:近年来,生长因子、多肽正成为国内外研究骨缺损修复的热点,其中降钙素基因相关肽(CGRP)与P物质(SP)等感觉神经肽被证明了积极参与骨稳态的调节。研究表明CGRP具有促进间充质干细胞向成骨分化的作用,SP作为促骨形成的肽,参与骨缺损的愈合... 展开 背景:近年来,生长因子、多肽正成为国内外研究骨缺损修复的热点,其中降钙素基因相关肽(CGRP)与P物质(SP)等感觉神经肽被证明了积极参与骨稳态的调节。研究表明CGRP具有促进间充质干细胞向成骨分化的作用,SP作为促骨形成的肽,参与骨缺损的愈合过程,促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的迁移、增殖和成骨分化,并加速细胞外基质的矿化。此外,CGRP、SP在骨的分解代谢上作用似乎相反。CGRP被报道通过抑制破骨细胞分化和活性来降低骨吸收,而SP被证明通过增强破骨细胞的生成和破骨细胞的活性来促进骨吸收。然而它们的作用通常是被单独研究,而不是作为一个有机整体。免疫系统在骨稳态的维持也起着重要作用,大量研究表明中性粒细胞、巨噬细胞、T辅助细胞等免疫细胞参与调节骨创伤的愈合。尽管研究证明了CGRP、SP参与调控骨再生的过程,但其具体作用机制以及它们是否相互作用,相关的免疫反应如何参与,仍有待进一步研究。 目的:1、通过体内实验探究干预CGRP和SP的生理性变化规律对骨创伤愈合过程的作用并且初步探索其机制。2、通过体外实验研究CGRP和SP对成骨、破骨向分化的影响。3、通过体外实验研究CGRP和SP对中性粒细胞功能及表型的影响。 方法:1、建立小鼠骨折模型,X线片拍摄验证模型,局部注射重组神经肽或相应的拮抗剂,X线片拍摄,HE染色观察干预生理性CGRP/SP值的变化规律对骨折愈合不同时期的影响。通过免疫荧光染色、流式细胞分析来观察骨创伤愈合过程中免疫细胞的变化。 2、在不同CGRP/SP条件下诱导RAW264.7细胞破骨分化及MG63细胞成骨分化,通过Q-PCR检测破骨、成骨分化相关基因的表达,免疫荧光染色观察细胞形态,ALP染色、茜素红染色法探讨其对破骨、成骨向分化的影响。 3、分离提取小鼠的原代骨髓中性粒细胞,分析体外低中高CGRP浓度背景下不同CGRP/SP条件下细胞活力、释放活性氧(ROS)、吞噬活性以及释放中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的功能改变。 结果:1、在骨折愈合过程中,添加CGRP提高CGRP/SP比值,可使2周时骨痂形成更好,4周时骨痂重构更快,同时添加CGRP和SP可观察到增厚性的骨痂产生,骨重塑延迟;早期中性粒细胞数目的特征性变化也提示了CGRP和SP的对骨愈合的作用是相互影响的。 2、采用不同浓度比例的CGRP+SP混合物(CGRP10-8M、SP10-7M、10-8M和10-9M)体外实验进一步表明其对RAW264.7细胞破骨向分化的作用紧密依赖于这两种肽。单独应用CGRP对破骨细胞激活作用可被SP的共添加剂量依赖性地抑制。而不同比例CGRP+SP混合物对MG63细胞的成骨向分化的作用由CGRP占主导。 3、采用不同背景浓度(CGRP10-7M、10-8M和10-9M)下分别加入SP(SP10-7M、10-8M和10-9M)刺激中性粒细胞。单独应用低浓度的CGRP初期对中性粒细胞活力有促进作用,同时抑制ROS的释放,对其吞噬功能和NETs的释放无明显干扰,而在添加中等浓度SP显著抑制其细胞活力和ROS的释放,添加低、高浓度SP可显著抑制其吞噬功能,对其余CGRP驱动的中性粒细胞功能改变无明显影响。单独应用中、高浓度的CGRP初期对中性粒细胞活力、ROS的释放有显著的抑制作用,不影响其吞噬功能和NETs的释放,而这些作用可被SP的共添加剂量依赖性地干扰或逆转。 结论:本研究证明打破CGRP和SP在骨创伤愈合过程中的生理性波动会干扰骨愈合,且早期炎症细胞激活也提示CGRP、SP的作用可能是相互依赖并与免疫反应密切相关的。CGRP和SP可以直接调控破骨、成骨细胞,也可以通过调控免疫反应来参与在骨中发挥生理功能,调节CGRP/SP的值可能比单一神经肽的应用更能作为治疗创伤相关骨病的有效靶点。 收起
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