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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 人工关节置换作为治疗各种中、晚期关节炎方法之一,成功地改善患者的关节功能,提高了患者的生活质量,己被人们所认可和接收。但是关节置换后,人工关节组件磨损造成了假体和宿主骨界面产生大量的微小磨损颗粒,这些磨损颗粒导致假体周围和宿主骨之... 展开 人工关节置换作为治疗各种中、晚期关节炎方法之一,成功地改善患者的关节功能,提高了患者的生活质量,己被人们所认可和接收。但是关节置换后,人工关节组件磨损造成了假体和宿主骨界面产生大量的微小磨损颗粒,这些磨损颗粒导致假体周围和宿主骨之间发生骨溶解,进一步诱导假体松动的问题始终并没有得到很好解决[1]。以往的研究结果来显示,假体周围骨溶解主要是由于磨损颗粒造成的骨吸收和骨重建平衡紊乱[2,3],但具体的机制仍然不明确。随着近些年对骨重建和骨改建研究的深入,以骨细胞为中心调节骨组织的骨形成和骨吸收这一机制被发现。我们先前研究显示,Ti颗粒的刺激下小鼠颅骨骨溶解模型中硬化素蛋白(sclerostin)表达增加,骨组织中Wnt信号通路中一些特征性蛋白表达受抑制。通过病毒转染降低sclerostin表达,可部分缓解小鼠颅骨表面的骨溶解[2]。Sclerostin作为骨细胞的特征蛋白,表明了骨细胞参与了假体周围骨溶解过程,因而有必要进一步探讨骨细胞在假体周围骨溶解过程的机制。本论文旨在通过体外实验和动物实验研究钛颗粒对骨细胞和成骨细胞的影响,从骨形成角度进一步探讨骨细胞参与假体周围骨溶解的机制。 本课题分为二个部分 一、钛颗粒分别对骨细胞,以及在共培养条件下对成骨细胞的影响 不同浓度的钛颗粒干预MLO-Y4骨细胞株后,检测钛颗粒对MLO-Y4细胞增殖,细胞周期、凋亡的影响,以及对MLO-Y4细胞sclerostin、β-catenin、connexin43等表达的影响。结果显示随Ti颗粒浓度的增加,细胞增殖逐渐减弱,凋亡逐渐增加,细胞周期停滞在S期,同时sclerostin的表达逐渐增加,Wnt信号通路中的β-catenin表达逐渐降低,钛颗粒损害了MLO-Y4骨细胞功能。 将MLO-Y4骨细胞系和MC3T3-E1成骨前体细胞系采用直接接触和非接触两种不同共培养方式培养,钛颗粒仅干预MLO-Y4骨细胞株,不干预MC3T3-E1成骨细胞,分别检测6天和14天MC3T3-E1成骨细胞ALP和钙结节变化,以及成骨细胞分化标记物的表达,比较两种共培养状态下,受损的骨细胞对成骨细胞分化影响的差异。结果显示,与对照组相比,钛颗粒作用于骨细胞后,在骨细胞与成骨细胞直接接触条件下,骨细胞的变化抑制了成骨细胞ALP表达和钙结节的形成,抑制了Osterix,Runx-2,骨钙素(OCN)等成骨标记物的表达。而在两种细胞非接触条件下,骨细胞的变化对成骨细胞功能的抑制并不明显。由此可见钛颗粒对成骨细胞功能的抑制主要是通过骨细胞与成骨细胞直接接触发挥作用的。考虑到connexin43这种连接蛋白主要在骨细胞表达,而且可以通过形成半通道和缝隙连接发挥作用。为此,检测了MLO-Y4细胞在钛颗粒的干预下缝隙连接蛋白connexin43的表达变化情况。结果显示MLO-Y4细胞的connexin43随钛颗粒干预浓度的增加而增加。 二、Connexin43通过Wnt信号通路参与骨细胞对成骨细胞分化的调控 分别用慢病毒转染方式使MLO-Y4细胞的connexin43低表达和过表达,检测其对MLO-Y4细胞增殖,周期的影响,以及对MLO-Y4细胞Wnt相关蛋白检测以了解MLO-Y4细胞Wnt信号通路的变化。结果显示connexin43低表达MLO-Y4细胞的促进了细胞增殖,S期细胞显著增加,β-catenin表达显著增加。反之,connexin43过表达的MLO-Y4细胞抑制了细胞增殖,细胞周期停滞在G0/G1期,β-catenin表达显著降低,Wnt信号通路受到抑制。 将MC3T3-E1细胞的connexin43低表达和过表达后,诱导进行成骨分化培养,检测ALP和茜素红染色,Western-blot检测早晚期成骨分化指标和Wnt相关蛋白的表达情况。结果显示,connexin43低表达增加了ALP和钙结节阳性染色细胞数量,ALP,Runx2,Osterix及β-catenin表达增加,促进了成骨细胞的分化,Wnt信号通路被活化。反之,connexin43过表达抑制了成骨细胞分化和Wnt信号通路。 分别将connexin43低表达或过表达的MLO-Y4骨细胞与MC3T3-E1成骨细胞直接接触共培养后进行ALP和茜素红染色,Western-blot检测早晚期成骨分化指标及Wnt相关蛋白的表达情况。再次用Ti颗粒干预connexin43低表达的MLO-Y4骨细胞,将骨细胞与成骨细胞直接接触共培养,检测成骨细胞的成骨分化能力。最后结合connexin43选择性基因敲除小鼠(骨细胞的connexin43被敲除)进行动物实验的验证。结果显示在共培养条件下,低表达connexin43的MLO-Y4对MC3T3-E1的成骨细胞分化指标的促进作用显著增加,成骨细胞的β-catenin表达显著增加。connexin43低表达的骨细胞受Ti颗粒影响减少,部分缓解了对成骨细胞分化的抑制作用。connexin43敲基因小鼠成骨分化的相关指标ALP,Runx2,Osterix,OCN及β-catenin表达增加显著高于野生型小鼠。 结论:Ti颗粒通过诱导骨细胞connexin43表达增加,引起骨细胞Wnt信号通路下传减少,进而抑制与之直接接触的成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路,抑制成骨细胞核内β-catenin对Runx-2的激活,进一步抑制成骨细胞分化。 收起
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