摘要: 一、研究背景及目的 肾单位肾痨(Nephronophthisis,NPHP)是导致儿童终末期肾病(ESRD)最常见的单基因遗传疾病，NPHP1基因突变所致的Ⅰ型肾单位肾痨临床最为常见。其特征性病理改变主要集中在皮髓质交界处的肾小管间质，包括肾小管囊性扩张和或囊肿... 展开 一、研究背景及目的 肾单位肾痨(Nephronophthisis,NPHP)是导致儿童终末期肾病(ESRD)最常见的单基因遗传疾病，NPHP1基因突变所致的Ⅰ型肾单位肾痨临床最为常见。其特征性病理改变主要集中在皮髓质交界处的肾小管间质，包括肾小管囊性扩张和或囊肿形成、炎症、纤维化和基底膜不规则增厚或变薄。NPHP发病机制尚不清楚，临床缺乏有效治疗手段。GEF-H1是与微管结合的RhoA激活因子，当从微管解离后激活RhoA,使其与GTP结合。活化的RhoA充当分子开关，调节细胞增殖、分化、极化、形态和收缩等，参与多种病理生理过程。有研究发现RhoA在NPHP小鼠模型中是激活的，但GEF-H1/RhoA信号通路在NPHP发病中的作用尚不清楚。本研究拟利用课题组前期成功构建的NPHP1基因敲除(NPHP1KO)小鼠模型和NPHP1基因敲低(NPHP1KD)的细胞模型，探讨GEF-H1/RhoA信号通路在NPHP发病机制中的作用，以期为疾病治疗寻求新的靶点。 二、研究方法 1.体内实验 首先通过蛋白质免疫印迹和免疫荧光检测到GEF-H1在NPHP1KO小鼠肾组织中的表达和分布以及GTP-RhoA的水平。然后，我们将携带重组GEF-H1-cDNA质粒(AAV-shGEF-H1)和对照质粒(AAV-eGFP)的腺相关病毒9型注射到4-5周龄的小鼠肾脏，并设置6个分组:野生型小鼠组(WT)、野生型小鼠病毒对照组(WT-AAV-eGFP)、野生型小鼠病毒敲低组(WT-AAV-shGEF-H1)、NPHP1敲除小鼠组(NPHP1KO)、NPHP1敲除小鼠病毒对照组(NPHP1KO-AAV-eGFP)、NPHP1敲除小鼠病毒敲低组(NPHP1KO-AAV-shGEF-H1),待到24周龄取材。通过蛋白质免疫印迹和免疫荧光检测病毒的干扰效率，最后通过免疫荧光和病理染色等检测囊肿、炎症和纤维化以及肾外器官的受累情况。此外，采用RhoA活性试剂和蛋白质免疫印迹分别检测下游分子GTP-RhoA和p-MLC2的表达。 2.体外实验 在体外慢病毒转染构建的NPHP1稳定敲低(NPHP1KD)的HK2细胞中，首先通过蛋白质免疫印迹和RhoA活性试剂分别检测了GEF-H1表达和GTP-RhoA的水平。然后通过小干扰RNA敲低GEF-H1,检测E-cadherin和α-SMA的表达变化。 3.统计学处理 独立重复实验至少3次，数据用平均数±标准误表示。采用Student''st检验和单因素方差分析比较差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。使用GraphPadPrism9.3.0软件进行统计学分析。 三、研究结果 1.体内实验 我们观察到NPHP1KO小鼠肾组织GEF-H1表达量增加以及在细胞内的位置发生变化，GTP-RhoA水平增加，表明在NPHP1KO小鼠肾组织GEF-H1/RhoA信号通路被激活。蛋白质免疫印迹和免疫荧光检测到AAV载体转染小鼠成功敲低GEF-H1的表达。敲低GEF-H1表达的NPHP1KO小鼠肾脏囊肿形成、纤维化和炎症得到改善，皮髓质交界处的囊肿和小管扩张数量减少、HE染色的炎性细胞和Masson染色的胶原纤维以及F4/80和α-平滑肌肌动蛋白代表的炎症和纤维化指标也下降，伴随着下游分子GTP-RhoA和p-MLC2的水平降低。而血尿素氮和肌酐等肾脏功能指标和肾外脏器没有明显差异。 2.体外实验 NPHP1KDHK2细胞中GEF-H1表达和GTP-RhoA水平也增加，提示GEF-H1/RhoA通路激活。敲低GEF-H1的表达通过增加上皮标志物E-cadherin,以及减轻纤维化标志物α-SMA缓解上皮间质转化(EMT)。 四、研究结论 GEF-H1/RhoA信号通路在NPHP1KO小鼠肾组织和NPHP1KDHK2细胞中被显著激活。敲低GEF-H1表达，可阻断RhoA/MLC2信号通路，改善NPHP1KO小鼠肾脏的病理改变。提示GEF-H1/RhoA信号通路在NPHP发病机制中起重要作用，为寻求NPHP治疗靶点提供了新的线索。 收起