摘要: 脂滴是肌内脂肪沉积的本质，沉积在肌纤维和肌肉组织脂肪细胞中的脂滴形成了肌内脂肪。脂滴具有独特且保守的单层磷脂膜结构，在能量代谢和蛋白周转中起到了重要的作用。然而脂滴的脂质和蛋白组成会伴随着细胞状态产生变化，这种高度动态性不仅赋予了... 展开 脂滴是肌内脂肪沉积的本质，沉积在肌纤维和肌肉组织脂肪细胞中的脂滴形成了肌内脂肪。脂滴具有独特且保守的单层磷脂膜结构，在能量代谢和蛋白周转中起到了重要的作用。然而脂滴的脂质和蛋白组成会伴随着细胞状态产生变化，这种高度动态性不仅赋予了脂滴多样的功能，也给研究造成了巨大的困难。本研究提供了一种快速简便的方法来产生稳定和纯净的人造脂滴，借助表征检测、粒径分析、激光共聚焦检测等手段检测其结构，通过蛋白孵育和细胞器互作等方式赋予其生物活性，并证明人造脂滴不仅具有抗应激和缓解脂毒性的功能，注射肌肉组织后也能够提高肌内脂肪的含量。主要研究结果如下: 1.人造脂滴的制备及其功能评价 (1)制备的纳米脂质颗粒为球形的磷脂单层包被结构。所制备的纳米脂质颗粒呈无粘连的球形，粒径为215.3nm,zeta电位为-11.2 mV。脂滴特异性染料染色阳性，且没有非球形结构。使用罗丹明标记的磷脂PE制备纳米脂质颗粒，激光共聚焦检测显示PE主要存在于颗粒外层，在内部没有分布。薄层色谱分离脂质测定，结果显示磷脂/总脂质比例为8.5％,表明纳米脂质颗粒上存在单层磷脂结构。 (2)纳米脂质颗粒具有较好的稳定性并可被制成冻干粉。将纳米脂质颗粒在25℃和4℃下分别保存,7天时其浓度或大小没有明显变化，也没有非球形结构产生。5％的甘露醇能够作为冻干保护剂，冻干后的样品为白色疏松多孔的粉末，表面光滑,均匀细腻。复溶时粉末可以快速重新分散，分散后呈白色乳状。 (3)脂质组分影响纳米脂质颗粒的粒径分布。提高转速和扩大甘油三酯和磷脂的比例能够增大纳米脂质颗粒的粒径。其它脂质组分，如磷脂酰乙醇胺、胆固醇、鲨烯、磷脂酰肌醇、溶血磷脂等均能形成纳米脂质颗粒，但它们对纳米脂质颗粒的粒径的影响各有不同。 (4)人造脂滴能够特异性的结合蛋白并与细胞器互作。银染实验表明纳米脂质颗粒能够结合ApoB和Plin5-GFP蛋白，但不能结合Seipin,说明这种蛋白结合是特异的。从HepG2细胞中提取了线粒体，与人造脂滴共孵育2小时后发现它能够与线粒体发生接触，这种接触为今后细胞器互做的体外研究提供了希望。 （5）人造脂滴能够进入细胞并缓解H2O2引起的ROS,降低过量脂肪酸引起的脂毒性。人造脂滴能够直接降低H2O2的浓度，进入细胞后充当了脂肪酸的储存库,显著降低了细胞ROS水平，Cyto C蛋白的转移显著减弱，并缓解了脂毒性。 2.人造脂滴提高猪肌内脂肪的机制研究 （1）油酸的最佳浓度60μM。选择油酸作为脂质合成的激动剂，制备不同油酸浓度梯度的人造脂滴。分别孵育细胞后，脂质含量均得到显著提高且与油酸浓度呈正相关。油酸浓度为20μM时会引起细胞ROS的显著提高，但20-80μM浓度之间没有显著性差异。结合细胞ROS、增殖和脂质含量情况，选定油酸的最佳浓度为60μM。 （2）注射装载油酸的人造脂滴显著提高猪背最长肌的肌内脂肪含量。注射后肌内脂肪含量从1.5％显著提高到2.1％,油红O染色可见显著的阳性区域，肌肉纤维间可见线状的脂质沉积。组织荧光染色可见长条状存在的脂质，同时脂质合成酶DGAT1、DGAT2和PPARγ上调表达，说明该部位的脂质合成被激活。 （3）人造脂滴能够通过巨胞饮和网格蛋白依赖的内吞途径被细胞吸收。进一步探究其作用方式发现，巨胞饮作用抑制剂（AMI）和网格蛋白依赖的内吞途径抑制剂（CPZ）抑制剂能够显著抑制人造脂滴的吸收，而胞膜窖蛋白依赖的内吞途径抑制剂（MβCD）抑制剂对脂滴的吸收并没有显著影响，说明人造脂滴主要通过巨胞饮和网格蛋白依赖的内吞途径进入细胞。 （4）人造脂滴和游离油酸不能刺激脂质合成。单独孵育人造脂滴4h后，细胞脂滴数量达到最大，此后逐渐降低。脂质分解基因Lipe和Pnpla2表达上调，合成基因DGAT1/2表达下降;虽然细胞的脂质含量显著增加，但是低于脂质添加量，说明单独的人造脂滴不能刺激其自身脂质合成，小鼠腓肠肌中的试验结果也验证了该结论。游离油酸因为强疏水性无法被细胞吸收，注射组织后脂质含量也没有显著性变化。这些试验说明人造脂滴和游离油酸不能单独刺激脂质合成。 （5）油酸只有被装载入人造脂滴中才能起到刺激脂质合成的功能。无油酸的人造脂滴和游离油酸都不能增加细胞的脂质含量，对装载60μM油酸的人造脂滴也进行了相应的检测。脂滴结构蛋白Plin2、脂质合成酶基因DGAT1和DGAT2、脂肪酸结合蛋白Fabp4和通路基因PPARγ表达显著提高，说明了脂质代谢活动的增强和脂质合成通路的激活。注射后，腓肠肌的组织免疫染色可见明显的长条状脂质，TG含量显著提高并大于添加量，脂质合成相关基因和通路得到激活。 综上所述,上述研究建立了新的脂滴制备方法,能够快速制备纯净的人造脂滴，具有与内源性脂滴相同的结构，并能通过冻干粉长期保存;探索了脂质组成对人造脂滴性质的影响;人造脂滴在体外具有生物活性，能够特异性的结合蛋白并与细胞器发生互作;细胞孵育人造脂滴后能够降低H2O2诱导的氧化应激，缓解外源OA/PA刺激产生的脂毒性。并且，我们提供了一个新的增加肌内脂肪的方式，注射人造油酸脂滴能够刺激自身脂质合成，提高甘油三酯含量。同时，我们证明了游离油酸只有被装载入人造脂滴中才能进一步发挥作用。这些研究为脂滴的深入研究与利用提供了新的素材，为促进家畜肌内脂肪沉积提供了新的思路。 收起