摘要: 研究目的： 作为体内质量最大的实质性器官，肝脏能够执行多种生物学功能，包括血浆蛋白和凝血因子的产生、胆汁的分泌、糖代谢及脂质代谢的平衡以及生物毒素的转化排泄等。此外肝脏强大的再生能力也是区别于其他器官的重要特征，使其在受到损伤后... 展开 研究目的： 作为体内质量最大的实质性器官，肝脏能够执行多种生物学功能，包括血浆蛋白和凝血因子的产生、胆汁的分泌、糖代谢及脂质代谢的平衡以及生物毒素的转化排泄等。此外肝脏强大的再生能力也是区别于其他器官的重要特征，使其在受到损伤后能够短时间内恢复结构和功能的完整性。数十年来，人类对肝再生的探索已经取得初步的成果，然而对于非编码RNA在肝脏再生过程中扮演的角色还尚未明确。环状RNA（circularRNA）作为真核生物细胞中新发现的广泛存在的非编码RNA，参与人类器官的生长、机体的新陈代谢以及疾病的进展。虽然circRNA在肝脏多种病理发展（肝纤维化、肝癌）过程中的功能已被接受和认可，但circRNA在肝再生过程的调控作用尚不完全清楚。 人类脂多糖反应性米色锚基因（LRBA）早已被证实能够促进多种肿瘤细胞的增殖，然而其环状分子circLRBA的生物学功能至今尚未有报道，尤其是在肝脏的病理生理过程中。本研究的主要目的是探索circLRBA在肝再生过程中发挥的生物学功能与调控机制，这将为进一步揭示肝再生的分子网络提供更多的理论信息和实验数据。 材料与方法： 1、我们首先构建了野生型小鼠2/3肝部分切除模型，对术后不同时间点的肝组织进行取材，通过免疫组化染色检测不同时间点肝组织BrdU阳性细胞比例；随后qRT-PCR验证亲本基因LRBA及携带的8条circRNAs（circLRBA1-8）在肝再生过程中的表达趋势，筛选出表达变化和肝再生过程相契合的circRNA进行下一步研究；通过设计合成特异的shRNA和过表达慢病毒，稳定敲低和升高circLRBA在小鼠正常肝细胞（AML12）和肝癌细胞系（Hepa1-6）中的表达水平，随后通过CCK-8细胞实验、EDU增殖实验及细胞周期实验验证circLRBA对肝细胞增殖和周期的调控作用；最后通过Westernblot验证两种细胞株不同干预下（基因敲低/升高）对细胞周期蛋白表达的影响； 2、通过设计合成携带shRNA序列的circLRBA腺相关病毒及阴性对照病毒，经小鼠尾静脉注射，构建体内circLRBA基因敲低模型，对构建成功的小鼠进行2/3肝部分切除术，对肝再生重要的时间点（0h、24h、36h、48h、120h）进行取材，qRT-PCR检测不同时间点实验组和对照组circLRBA的表达，免疫组化染色检测两组BrdU、Ki67和pH3S10的阳性细胞比例，计算两组不同时间点的残肝/体重比，血清学检测两组肝功能相关指标——总胆红素（TB）、谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）的浓度，最后通过Westernblot验证实验组和对照组不同时间点细胞周期蛋白表达水平； 3、选取circLRBA稳定敲低的AML12细胞系和对照细胞，以及circLRBA稳定敲低的2/3肝部分切除后36h取材肝组织和阴性对照组36h取材肝组织进行转录组测序，在测序检测到的基因中筛选出差异性表达的基因，对差异性表达的基因进行GO功能富集、KEGG通路富集以及PPI蛋白相互作用网络构建； 4、生信分析预测circLRBA能够“海绵样”吸附的miRNA分子，选取和肝再生相关的miRNA进行双荧光素酶报告实验验证，并通过miRNA抑制剂（inhibitor）验证下游miRNA对AML12及Hepa1-6细胞增殖的调控作用；通过免疫共沉淀实验（ChIRP）富集circLRBA可能结合的蛋白，蛋白质谱分析筛选合适的结合蛋白，并通过RNA免疫共沉淀（RIP）、蛋白免疫共沉淀（Co-Ip）及细胞免疫荧光技术验证彼此的作用关系。 研究结果： 1、野生型小鼠2/3肝部分切除术后不同时间点BrdU染色发现，术后36h为肝细胞阳性染色比例最高的时间点，DNA复制及有丝分裂活动旺盛。通过对LRBA转录后产生的8条circRNA分子进行筛选，结合BrdU染色发现mmu-circ-0010831在小鼠肝再生过程中的表达趋势最为理想，和LRBA基因的表达趋势也具有协同性，均表现为促进肝再生的趋势；在小鼠AML12和Hepa1-6细胞株的体外实验发现，circLRBA基因敲低后的细胞增殖减慢、细胞周期阻滞，分裂期细胞比例明显减少，而circLRBA过表达的细胞株中可以观察到细胞的增殖活力增加、细胞周期加快，分裂期细胞比例显著增加；在circLRBA敲低的AML12和Hepa1-6细胞中，细胞周期相关蛋白cyclinA2/cyclinE1/cyclinD1/CDK2/CDK4/pH3S10的表达较对照组减弱，而circLRBA过表达的两种细胞系中，对应细胞周期蛋白的表达明显增强； 2、在circLRBA敲低的小鼠肝部分切除后于24h、36h及48h取材的肝组织中，残肝/体重比和对照组相比显著降低，而血清生化（ALT、AST和TB）水平发生显著升高；免疫组化染色发现circLRBA敲低的小鼠在24h、36h及48h的肝组织中三种免疫组化指标（BrdU、Ki67、pH3S10）的阳性细胞染色比例相比对照组明显降低，细胞周期蛋白cyclinB1/CDK2/CDK4/pH3S10的表达水平也明显低于对照组； 3、CircLRBA敲低后的肝细胞样品转录组测序发现共有987个基因的表达水平发生了显著改变，其中456个基因的表达水平发生了显著上调，531个基因的表达水平发生了显著下调；肝组织样品测序检测出535个差异性表达的基因，其中上调基因292个，下调基因243个；通过对差异性基因的GO富集发现有丝分裂周期的调控、核糖核苷酸的代谢过程及细胞周期的负性调控等条目被显著富集；对差异性基因的KEGG富集发现许多关键的肝再生相关信号通路（Hipposignalingpathway、p53signalingpathway、HIF-1signalingpathway等）被显著富集；PPI网络的构建进一步筛选出细胞周期蛋白之间的相互关系网络； 4、生信分析结果显示，let-7i、miR-26a和miR-29a是circLRBA的潜在下游靶向miRNAs。双荧光素酶报告实验进一步证明circLRBA能够和let-7i和miR-29a相互结合，然而体外实验发现let-7i和miR-29a对肝细胞增殖不具有调控作用；ChIRP实验及蛋白质谱分析筛选出靶基因特异性结合的蛋白RNF123，其下游调控的细胞周期抑制剂p27与circLRBA在肝细胞与肝组织中的表达呈反向趋势，RIP实验、Co-Ip及细胞免疫荧光实验证实circLRBA/RNF123/p27之间存在结合作用关系，可以形成RNA-蛋白复合物调控肝再生的进程。 研究结论： CircLRBA作为一种表达于真核细胞质的稳定非编码RNA，能够通过结合E3泛素化连接酶RNF123来间接调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27的表达，进而调控肝细胞的周期和增殖，在肝切除后发挥促进组织再生，加速肝脏结构和功能修复的作用。因此我们的研究有助于进一步理解环状RNA与肝再生的关系，为肝再生的深入探索甚至未来肝病的临床治疗提供新的依据。 收起