摘要: 口腔颅颌面骨组织缺失是口腔疾病最常见的临床结局之一[1-2]。由于口腔颅颌面骨组织对牙齿正常功能的行使，以及进食、发音等重要的生命功能不可或缺，因此有效地再生口腔颅颌面骨组织是临床实践中亟需实现的目标[1-3]。口腔颅颌面骨组织损伤修复过程... 展开 口腔颅颌面骨组织缺失是口腔疾病最常见的临床结局之一[1-2]。由于口腔颅颌面骨组织对牙齿正常功能的行使，以及进食、发音等重要的生命功能不可或缺，因此有效地再生口腔颅颌面骨组织是临床实践中亟需实现的目标[1-3]。口腔颅颌面骨组织损伤修复过程中，间充质干细胞（MesenchymalStemCell，MSC）是重要的内源性干细胞来源（stemcellresource）；同时由于其具有自我更新、多向分化潜能（成骨、成牙、成软骨、成脂等）、取材方便、免疫原性低等优势，故也被视为颅颌面硬组织再生治疗理想的种子细胞[3-5]。因此，了解MSC成骨/牙向分化的机制，进而寻找到可能的干预靶点，可以为促进口腔颅颌面骨组织的再生提供重要的实验基础和转化靶点。本论文基于上述问题，首次阐明了Ca2+/NFATc1在MSC成骨分化及骨再生中的作用及分子机制，为MSC依赖的骨再生研究提供了基础。 课题组前期研究结果表明，成骨细胞来源的Wnt7b可通过旁分泌作用增强MSC中NFATc1的核转位，从而促进MSC的成骨向分化[6]，但Ca2+/NFATc1信号本身对于MSC成骨分化的具体作用及分子机制目前仍不明确。因此，本论文着眼于阐释Ca2+/NFATc1信号在MSC成骨分化中的具体作用及分子机制，进而理解该信号在MSC成骨分化和骨再生中的生物学作用。 方法：本课题通过高通量测序、核浆蛋白检测、核转位成像、钙内流监测（calciuminflux）、转基因动物谱系示踪实验等探究了NFATc1在MSC成骨分化中的表达和活化情况；采用小分子抑制药物、基因敲低、病毒过表达、动物骨折再生模型、裸鼠皮下移植手术等明确了Ca2+/NFATc1在MSC成骨分化及骨再生中的作用；最后借助染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、RNA-seq、ChIP-qPCR、萤光素酶报道等实验研究了Ca2+/NFATc1调节MSC成骨分化的分子机制。 结果：借助多物种、多器官全基因测序、单细胞转录测序等高通量测序手段，明确了在人、小鼠、家猪的多种组织器官中，NFATc1在骨骼系统中高表达；单细胞测序结果进一步表明NFATc1主要高表达于成体MSC中。钙内流成像、NFATc1蛋白活化、核转位水平检测等实验发现：在骨形成相关细胞中，未分化的MSC是Ca2+的主要响应细胞而非分化后的成骨细胞、骨细胞；且Ca2+/NFATc1信号的活化程度在MSC成骨分化的早期阶段会一过性增强。而后通过转基因动物的谱系示踪实验（lineage-tracing），证明了NFATc1+MSC可在体内分化为成骨细胞从而参与骨形成。这些实验结果揭示了Ca2+/NFATc1对MSC成骨分化的重要生物学作用，即该信号的功能活化可能与MSC成骨分化正相关。进一步，本课题借助小分子药物、基因敲低、NFATc1持续活化病毒构建等一系列分子生物学实验验证了Ca2+/NFATc1与MSC成骨分化正相关的假说。具体如下：1）抑制Ca2+/NFATc1信号后MSC的成骨分化能力显著降低；2）增强该信号可促进MSC成骨分化；3）体内阻断Ca2+/NFATc1信号会显著抑制骨组织的再生，其中MSC的成骨分化受损是骨组织再生障碍的原因之一。至此，上述实验结果充分表明Ca2+/NFATc1信号对MSC成骨分化及骨再生重要的生物学作用。本课题利用ChIP-seq筛选出了与MSC成骨分化相关的NFATc1下游基因OPG；随后借助ChIP-qPCR、萤光素酶报道等一系列分子生物学实验明确了NFATc1转录调节OPG基因的具体分子机制。最后，通过体外矿化诱导、裸鼠皮下移植等实验发现Ca2+/NFATc1信号调节MSC成骨分化必须依赖于其对OPG的转录，由此可知OPG是Ca2+/NFATc1信号介导MSC成骨分化的下游靶基因。 结论：经过体内外实验的相互印证，我们得出以下结论：1）Ca2+/NFATc1信号活化对于MSC的成骨分化不可或缺；2）NFATc1蛋白可直接结合到OPG的转录起始区域从而启动OPG的表达，最终实现对MSC成骨分化的调节。 综上所述，本课题通过一系列体内外实验首次报道了Ca2+/NFATc1信号对MSC成骨分化及骨再生的重要作用，并且进一步揭示了该作用的分子生物学机制。这些发现将为口腔颅颌面骨/牙组织再生研究提供全新的知识和临床转化的基础资料。 收起