摘要: 第一部分骨形态蛋白-2 对人脐带间充质细胞增殖和分化的影响 目的:探讨骨形态发生蛋白-2（bmp-2）对人脐带间充质干细胞（hUCMSC）的增殖和分化的影响。 方法:体外培养人脐带间充质干细胞，用流式细胞仪鉴定细胞表面CD34、CD45、CD105、CD45、C... 展开 第一部分骨形态蛋白-2 对人脐带间充质细胞增殖和分化的影响 目的:探讨骨形态发生蛋白-2（bmp-2）对人脐带间充质干细胞（hUCMSC）的增殖和分化的影响。 方法:体外培养人脐带间充质干细胞，用流式细胞仪鉴定细胞表面CD34、CD45、CD105、CD45、CD73和HLA-DR分子的表达。实验分为6组，分别是10%血清DMEM、10%血清DMEM+成骨诱导培养基、10%血清DMEM+BMP-2(20ug/ml)、2%血清DMEM、2%血清DMEM+成骨诱导培养基、2%血清DMEM+BMP-2(20ug/ml)，噻唑蓝(MTT)比色法观察不同培养基培养对人脐带间充质干细胞的增殖影响，流式细胞术检测BMP-2 作用后细胞表面STRO-1表达的变化，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测量BMP-2 作用后人脐带间充质干细胞的骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）、I 型胶原蛋白(COL1)的mRNA表达变化，碱性磷酸酶染色观察人脐带间充质干细胞在BMP-2 培养基作用下细胞碱性磷酸酶表达阳性细胞的比例变化，Von kossa 染色试验观察BMP-2 对人脐带间充质干细胞钙结节形成的情况。 结果:人脐带间充质干细胞经流式细胞术鉴定为CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)细胞。对比无BMP-2和加BMP-2的培养基中培养细胞1，3，5，7天，虽然细胞的增殖率在上升，但是在组间比较，无明显意义，同时在2%血清的培养基中培养7天后，hUCMSC的增殖促进才10%左右。BMP-2 培养7天后细胞表面STRO-1 阳性细胞比例上升明显，由25.1±4.0 上升至51.1±6.4。BMP-2 培养条件下，COL1mRNA的表达可以见到增强，OPNmRNA出现表达，ALPmRNA 比无BMP-2 培养出现明显增强。在BMP-2 培养条件下，碱性磷酸酶染色出现大片阳性染色。在培养28天，Von kossa 染色出现明显的钙结节。 结论：骨形态发生蛋白-2 对人脐带间充质干细胞成骨诱导分化作用明显，而增殖作用很弱。 第二部分锶对人脐带间充质细胞成骨分化影响的研究 目的：探讨氯化锶诱导人脐带间充质干细胞（hUCMSC）成骨分化过程中β-连接蛋白（β-Catenin）的作用。 方法：体外培养人脐带间充质干细胞，实验分为3组，空白组：10%胎牛血清+DMEM培养基，对照组：10%胎牛血清+DMEM 培养基+成骨培养基，实验组：10%胎牛血清+DMEM培养基+氯化锶，检测3组不同培养基培养后人脐带间充质细胞的碱性磷酸酶活性变化。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测量人脐带间充质干细胞的骨桥蛋白（OPN）、β-Catenin、I 型胶原蛋白(COL1)的mRNA表达变化，蛋白印迹法检测β-Catenin 蛋白表达的变化。荧光染色观察在加入氯化锶的培养基中β-Catenin的表达。Von kossa 染色试验观察人脐带间充质干细胞钙结节形成的情况。 结果：实验组细胞在第5天，碱性磷酸酶活性由39.871±8.166 U/g.prot 增加到70.317±14.231U/g.prot，在第14天，实验组的碱性磷酸酶的活性可以高达138.617±40.207 U/g.prot，与空白组和对照组相比都有明显增加。在实验组人脐带间充质干细胞的碱性磷酸酶（ALP）mRNA 出现高表达。空白组的骨桥蛋白（OPN）表达很弱，而对照组和实验组的OPN 出现明显的表达。对比空白组和对照组，实验组I 型胶原蛋白（COL1）的表达可以见到明显增强。空白组的β-Catenin 蛋白表达很弱，而对照组和实验组的β-Catenin 蛋白出现明显的表达。细胞荧光观察到在还有氯化锶培养基中培养的细胞中出现细胞浆内红色荧光，部分细胞核也有红色荧光。含有氯化锶的培养基中培养28天后，可以看到hUCMSC 形成大量的钙结节。 结论：β-Catenin是氯化锶诱导人脐带间充质干细胞细胞成骨诱导分化中重要通路蛋白。 第三部分骨形态蛋白-2 联合氯化锶对人脐带间充质细胞成骨分化实验 目的：探讨骨形态发生蛋白-2（bmp-2）联合氯化锶对人脐带间充质干细胞（hUCMSC） 的增值和分化的影响。 方法：体外培养人脐带间充质干细胞，实验分为3组，空白组：10%胎牛血清+DMEM培养基，对照组：10%胎牛血清+DMEM 培养基+成骨培养基，实验组：10%胎牛血清+DMEM培养基+BMP-2+氯化锶，噻唑蓝(MTT)比色法观察人脐带间充质干细胞的增值效果，并检测3组不同培养基培养后人脐带间充质细胞的碱性磷酸酶活性变化，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测量不同组人脐带间充质干细胞的骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）、I 型胶原蛋白(type 1collagen,COL1)的mRNA表达，蛋白印迹法检测smad和p38 蛋表达的变化。von kossa染色试验观察人脐带间充质干细胞钙结节形成的情况。 结果：实验组的人脐带间充质干细胞增殖率在第5天和第7天是明显高于空白组和对照组。实验组细胞在第5天，碱性磷酸酶活性就由33.443±9.061U/g.prot 增加到80.209±17.011 U/g.prot，在第14天，实验组的碱性磷酸酶的活性可以高达145.705±45.871 U/g.prot，对比空白组和对照组都有明显增加。在实验组人脐带间充质干细胞的碱性磷酸酶（ALP）mRNA 出现高表达。空白组的骨桥蛋白（OPN）表达很弱，而对照组和实验组的OPN 出现明显的表达。对比空白组和对照组，实验组I 型胶原蛋白（COL1）的表达可以见到明显增强。实验组中人脐带间充质干细胞的Smad1/5/8 蛋白出现高表达。空白组的P38 蛋白表达很弱，而对照组和实验组的P38 蛋白出现明显的表达，含有BMP-2和氯化锶的培养基中培养28天后，可以看到hUCMSC 形成大量的钙结节。 结论：联合骨形态发生蛋白-2和氯化锶对人脐带间充质干细胞细胞增殖和成骨诱导分化都有促进作用。 第四部分 BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料制备和颅骨缺损修复实验 目的：制备BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料并探讨其修复大鼠颅骨缺损的可行性和有效性。 方法：用1 型胶原制备单纯胶原、胶原/羟基磷灰石、胶原/掺锶羟基磷灰石、BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石4组骨修复材料，并进行扫描电镜观察4 种材料表面的结构。实验动物分为4组，每组12只大鼠，在大鼠头颅制备颅骨极限骨缺损模型，并将上述骨修复材料分别植入骨缺损处。术后12周取大鼠颅骨，CT 扫描观察骨缺损修复影像学。HE和Masson 染色观察骨缺损组织学，并在骨缺损及其周围新生骨部位行骨桥蛋白（OPN）和β-catenin 免疫组织化学染色。 结果：在扫描电镜下检测，可以发现单纯的胶原材料为交织样物质结构，胶原/羟基磷灰石材料为交织晶体板状结构。胶原/掺锶羟基磷灰石和BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料晶体结构为单晶体交织状。12周后，骨缺损颅骨CT 扫描发现单纯胶原组的颅骨缺损可见轻微的云雾状高密度影，三维重建可见明显的骨质缺损，骨缺损部位平均CT 值为98.5±10.2 hu。而胶原/羟基磷灰石材料、胶原/掺锶羟基磷灰石、BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料在12周颅骨缺损部位都有片状高密度影，但是骨缺损部位的CT 值有明显的差异，BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料缺损部位CT 值最高。HE和Masson 染色见BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石组，骨质愈合完全，原骨缺损处多为红色成熟骨。胶原/掺锶羟基磷灰石组植入区内蓝色的新生骨较多，材料边缘与骨组织结合紧密牢固，骨痂桥接完全，内含成熟骨。胶原/羟基磷灰石材料组植入区，在植入材料边缘新生骨形成，界限仍然清晰。单纯胶原组骨质未愈合，骨缺损处为大量胶原组织，淡蓝色条索状结构，中间未见软骨及成熟骨形成。BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石组存在大量棕色的骨桥蛋白和β-catenin 染色阳性新生骨组织，而胶原/掺锶羟基磷灰石组和胶原/羟基磷灰石组的骨桥蛋白和β-catenin 阳性新生骨组织依次减少，在单纯胶原组染色仅见散在少许骨桥蛋白阳性和β-catenin阳性细胞。 结论：BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料促进骨修复能力强于单纯胶原、胶原/羟基磷灰石、胶原/掺锶羟基磷灰石。BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料是一种成骨诱导活性良好的骨缺损修复材料。 收起