摘要: 背景和研究目的 钛材因细胞相容性好、机械性能优、且有一定的耐腐蚀性，广泛应用于修复种植体、正畸种植钉和骨科修复材料中，钛种植体更是目前种植修复的金标准。在大多数临床可用的种植体系统中，钛通过完善的喷砂酸蚀(SLA)方案进行表面改性，以... 展开 背景和研究目的 钛材因细胞相容性好、机械性能优、且有一定的耐腐蚀性，广泛应用于修复种植体、正畸种植钉和骨科修复材料中，钛种植体更是目前种植修复的金标准。在大多数临床可用的种植体系统中，钛通过完善的喷砂酸蚀(SLA)方案进行表面改性，以显著提高其粗糙度、亲水性、细胞粘附性，从而增强骨-种植体的骨整合。然而，在一些不利的骨条件下，如骨密度较低或者骨缺损的患者，喷砂酸蚀表面缺乏足够的促成骨生物活性来模拟成骨，以确保充分的骨修复和植入体骨整合。喷砂酸蚀的粗糙表面也极易受细菌粘附的影响，一旦感染出现种植体周围炎，可能导致种植失败。因此，寻求有效的材料改性方法使钛种植体表面具有促成骨和抗菌性能双重效应，提升种植成功率，是当前研究的热点。 在钛种植体上沉积金属纳米颗粒涂层是当前具有显著应用前景的表面改性方式，金属纳米颗粒涂层根据其不同的组成可以具有多种功能。例如，锶(Sr2+)、锌(Zn2+)、银(Ag+)和铜(Cu2+)等金属离子因具有较好的生物功能而在钛表面的改性中应用较广泛。其中，锶作为骨的主要组成元素之一，具有模拟Ca2+结构的功能，有良好的细胞相容性，可促进成骨，抑制破骨。银被公认具有优异的抗菌性能，并被证明对抗生素耐药的细菌有效，在中等浓度下，它可以有效杀死细菌而不会伤害宿主组织细胞。然而，银是严格的剂量依赖性金属，高浓度的银会引起细胞毒性。目前在银改性的钛表面覆盖SrTiO3纳米层是否能够抑制银离子的释放，并与锶离子的促成骨性能起到协同效果尚缺乏研究。因此，在银改性种植体表面沉积SrTiO3纳米层以降低细胞毒性并改善成骨性能的方法引起了我们的关注。然而在光滑的钛表面难以制备具有微纳结构的金属纳米涂层，亟需一种实用的表面改性方式制备具有微纳结构的金属纳米层以促进骨结合。 热碱处理作为一种表面改性的手段，可构建出具有模拟骨组织结构的海绵样纤维网状结构，该结构有利于纳米颗粒的负载。磁控溅射可通过高能溅射方法使靶材粒子发生溅射沉积在基底材料的外表面而制备可控、稳定和致密的金属纳米涂层。Safavi等人已经证明，在微/纳米表面上磁控溅射纳米层可以制造骨模拟表面结构。Li等人报告，具有微/纳米结构的表面有助于通过磁控溅射制备的金属纳米层的高强度结合。 因此，本研究通过结合热碱处理和磁控溅射来构建仿生微/纳米结构。在热碱处理的钛表面先溅射银涂层再溅射钛酸锶涂层，以构建微/纳米骨模拟表面(AH-Ti/Ag/Sr)，并探索该微/纳米骨模拟表面结构的促成骨和抗菌性能，为临床种植体的研发设计提供新思路。 研究方法 1.钛种植体表面制备钛酸锶微纳涂层并进行表征: 通过热碱处理钛材在其表面形成理想的亚微米纤维网状结构，通过磁控溅射法在热碱处理后的钛片上溅射钛酸锶，控制溅射时间从而形成不同厚度的钛酸锶涂层AH-Ti/Sr30、AH-Ti/Sr90、AH-Ti/Sr150。通过扫描电镜、能谱仪分析、水接触角测量、X射线衍射法测定、原子力显微镜观察、离子释放实验等对各样品涂层进行表征。 2.钛种植体表面钛酸锶微纳涂层对成骨细胞的促成骨性能评价: 体外细胞实验:将成骨细胞(MC3T3-E1)接种到Ti、AH-Ti、AH-Ti/Sr30、AH-Ti/Sr90、AH-Ti/Sr150表面进行培养，通过扫描电镜检测成骨细胞在各材料表面的粘附及生长情况，采用MTT法、碱性磷酸酶(ALP)活性分析、茜素红染色、qRT-PCR检测等分析各制备样品的表面对成骨细胞的增殖、粘附、生长状态、以及成骨向分化的作用，以评价各样品的成骨潜力。 体内动物实验:分析体外实验得到的结果，进一步选择在大鼠的股骨植入AH-Ti、AH-Ti/Sr90两组样品，通过显微CT对不同种植体周围的新骨形成进行定性和定量评价，通过苏木精-伊红染色和曼森染色来分析两组样品周围的新骨形成情况，以筛选出具有最佳成骨性能的目的材料及最佳涂层制备参数。 3.钛种植体表面锶/银微纳米仿生涂层的制备和表征: 通过磁控溅射法在热碱处理后的钛片上溅射一层均匀致密的纳米银涂层，并控制不同溅射时间以形成不同形貌的微纳结构。AH-Ti/Ag0.25、AH-Ti/Ag1、AH-Ti/Ag2、AH-Ti/Ag5，通过细胞活力检测实验获得具有最佳细胞活力最小细胞毒性的样品标记为AH-Ti/Ag，通过磁控溅射法在热碱处理后的钛片AH-Ti和已经溅射获得纳米银涂层的钛片AH-Ti/Ag上进一步溅射钛酸锶90分钟，制备含钛酸锶微纳涂层的钛种植体AH-Ti/Sr和含锶/银微纳米仿生涂层的钛种植体AH-Ti/Ag/Sr。通过扫描电镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)观察，X射线光电子能谱(XPS)、X射线衍射法(XRD)、X射线能谱仪(EDS)、水接触角(Watercontactangle)等进行检测，离子释放实验分析锶离子和银离子的释放趋势变化等方法，表征各样品涂层的性能。 4.钛种植体表面锶/银微纳米仿生涂层的促成骨和抗菌性能评价: 体外细胞实验:将成骨细胞(MC3T3-E1)接种到AH-Ti、AH-Ti/Ag、AH-Ti/Sr和AH-Ti/Ag/Sr等各样品表面进行培养，通过扫描电镜检测成骨细胞在材料表面的粘附及生长情况，采用CCK8法检测细胞活力、碱性磷酸酶活性分析、成骨细胞基质矿化实验、骨钙素的浓度测定、qRT-PCR检测成骨相关基因的表达等分析各制备样品表面对成骨细胞的增殖、粘附、生长状态、以及成骨向分化的作用，评价各涂层对成骨细胞的促成骨分化潜力。 体内动物实验:将AH-Ti、AH-Ti/Ag、AH-Ti/Sr、AH-Ti/Ag/Sr等种植钉植入到新西兰大白兔的上颌骨内，饲养一个月后处死大白兔，取出种植钉周围的骨组织。通过显微CT对不同种植体周围的新骨形成进行定性和定量评价，通过苏木精-伊红染色和曼森染色来分析不同种植体周围的新骨形成情况。 抗菌性能检测:在AH-Ti、AH-Ti/Ag、AH-Ti/Sr、AH-Ti/Ag/Sr等4组不同钛片上接种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，通过细菌涂板计数法和活/死细菌荧光染色法来评估钛材表面锶/银微纳米仿生涂层(AH-Ti/Ag/Sr)的抗菌性能。 结果 1.成功制备钛种植体表面钛酸锶微纳米涂层，其具有促成骨功能。 通过热碱处理和磁控溅射技术在钛种植体表面制备了系列具有不同分级的含钛酸锶微纳米仿生结构涂层。扫描电镜、能谱仪、水接触角、X射线衍射、原子力显微镜等结果表明:含钛酸锶微纳米仿生结构涂层的钛种植体被成功构建。其中AH-Ti/Sr90组具有最佳的促成骨分化功能，可促进骨质疏松及正常情况下种植体的骨结合，可作为后续实验的最佳涂层制备参数。 2.成功制备钛种植体表面锶/银微纳米仿生涂层，其具有促成骨和抗菌功能。 利用热碱处理和磁控溅射技术在钛种植体表面构建含锶/银微纳米仿生结构涂层。扫描电镜、X射线能谱仪分析、X射线光电子能谱检测、水接触角检测、离子释放实验等结果表明:锶/银微纳米仿生结构涂层的钛种植体被成功构建。体外细胞实验的结果显示AH-Ti/Ag组具有明显的细胞毒性，AH-Ti/Ag/Sr组与AH-Ti/Sr组均显示出良好的细胞形貌及细胞增殖活性，其中AH-Ti/Ag/Sr组较AH-Ti/Ag组具有更好的细胞活性和细胞铺展面积。动物体内实验的结果表明在AH-Ti/Ag/Sr组和AH-Ti/Sr组上观察到有更多的新骨形成。抗菌实验结果说明AH-Ti/Ag与AH-Ti/Ag/Sr组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抗菌活性，相比于AH-Ti/Ag/Sr组，AH-Ti/Ag的抗菌活性更强。 结论与意义 本研究利用热碱处理和磁控溅射技术在钛材表面构建具有不同分级的含钛酸锶微纳米仿生结构涂层的钛种植体，通过体内外实验证明在80W，溅射90分钟的参数下所制备的涂层(AH-Ti/Sr90)具有最佳的促成骨性能。在该研究的基础上进一步改性制备含锶/银微纳米仿生结构(AH-Ti/Ag/Sr)涂层的钛种植体，通过体内外成骨实验和抗菌实验证明了该涂层同时具有良好的生物相容性、促进成骨分化能力以及良好的抗菌活性，而且AH-Ti/Ag/Sr可适量缓慢释放银离子及锶离子，起到协同促进骨结合的功效。该研究为双重涂层的表面结构研发提供了理论依据，为种植体临床研发设计提供了新方向。 收起