摘要: 目的： 吗啡成为一种经典的阿片类镇痛药物已被广泛用于临床，然而长期使用吗啡会导致患者对其产生镇痛耐受，因而严重限制了吗啡在临床中的应用。已发现小胶质细胞的激活在吗啡耐受中起重要作用。最近，关于抑制小胶质细胞活化的药物研究越来越火... 展开 目的： 吗啡成为一种经典的阿片类镇痛药物已被广泛用于临床，然而长期使用吗啡会导致患者对其产生镇痛耐受，因而严重限制了吗啡在临床中的应用。已发现小胶质细胞的激活在吗啡耐受中起重要作用。最近，关于抑制小胶质细胞活化的药物研究越来越火热。青蒿素作为一线抗疟药已被广泛熟知，但除了抗击疟疾外，它还具有抗炎、抗肿瘤等多种作用。研究表明，双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小胶质细胞的活化。但DHA是否能够通过抑制小胶质细胞的活化缓解吗啡耐受还未有报道。因此，本研究旨在观察DHA抑制吗啡介导的小胶质细胞活化，并探讨其潜在机制，同时为DHA是否能缓解吗啡耐受进行初步探索。 方法： 为了探究DHA、小胶质细胞活化、吗啡耐受之间的关系，我们通过体外实验全面系统地研究了DHA在小胶质细胞活化和吗啡耐受中的作用和机制。通过吗啡处理小胶质细胞BV-2以模拟构建体外吗啡耐受模型，并设立米诺环素（minocycline）阳性对照组。首先通过浓度梯度（5、10、20、40μM）的DHA处理小胶质细胞BV-2，CCK-8实验检测细胞活力，以确定DHA处理小胶质细胞BV-2的最佳浓度。在预先使用不同浓度的DHA处理吗啡诱导的BV-2细胞中，再通过Westernblot测试小胶质细胞BV-2中IBa-1的表达量变化程度和ELISA检测细胞炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达水平变化，以明确DHA在体外抑制吗啡介导的小胶质细胞BV-2活化的作用。使用qRT-PCR方法，进一步研究miR-16在吗啡介导的小胶质细胞BV-2的活化中发挥重要作用。通过体外实验使用miR-16抑制剂处理小胶质细胞BV-2，观察DHA对小胶质细胞BV-2的活化作用。通过Starbase数据库发现，miR-16可以与TLR4结合，通过荧光素酶实验验证miR-16与TLR4之间可直接结合的相关关系，体外使用miR-16抑制剂观察DHA对小胶质细胞BV-2中TLR4/NF-κB信号通路的活化作用。 结果： 与对照组相比，随着DHA浓度的增加，小胶质细胞BV-2活性逐渐降低，DHA浓度为40μM时，细胞活性最低（P＜0.01），使用20μM的DHA对经吗啡预处理后的细胞活性的抑制作用与minocycline类似，因此选用20μM的DHA作为最佳浓度处理小胶质细胞BV-2。预先使用不同剂量的DHA处理吗啡诱导的BV-2细胞，Westernblot检测结果发现其小胶质细胞BV-2中IBa-1的表达呈剂量依赖性降低（P＜0.01-0.001）。与对照组相比，吗啡处理小胶质细胞BV-2后，ELISA检测显示细胞炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达显著增高（P＜0.001）；与吗啡处理组相比，预先使用不同剂量的DHA处理小胶质细胞BV-2，结果发现小胶质细胞中细胞炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达呈剂量依赖性降低（P＜0.05-0.001）。与对照组相比，吗啡处理后，IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平显著增加（P＜0.001）；与吗啡处理组相比，随着加入不同浓度的DHA，IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05-0.001）；阳性对照组minocycline也可降低细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达（P＜0.001）。qRT-PCR检测发现，与对照组相比，吗啡处理小胶质细胞BV-2后，miR-16的表达显著降低（P＜0.001）；与吗啡处理组相比，随着加入不同浓度的DHA，miR-16表达水平显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05-0.001）。ELISA检测发现，miR-16抑制剂处理小胶质细胞BV-2，可以显著降低DHA对于小胶质细胞BV-2的活化抑制（P＜0.001）。荧光素酶实验结果显示，TLR4与miR-16存在结合位点。与对照组相比，吗啡处理后，Westernblot检测结果发现TLR4表达水平显著增加（P＜0.001）；与吗啡处理组相比，DHA预处理小胶质细胞BV2后，TLR4表达水平显著降低（P＜0.001）；而miR-16抑制剂可以显著降低DHA对于小胶质细胞BV-2的TLR4的表达抑制（P＜0.001）。与对照组相比，吗啡处理后，免疫荧光检测结果发现NF-κB表达显著增加（P＜0.05）；与吗啡处理组相比，DHA预处理小胶质细胞BV-2后，NF-κB表达显著降低（P＜0.05）；而miR-16抑制剂可以显著降低DHA对小胶质细胞BV-2的NF-κB的表达的抑制（P＜0.05）。 结论： 本研究首次揭示了DHA可以通过调控miR-16的表达，抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化进而抑制小胶质细胞的活化。DHA通过抑制小胶质细胞的激活和神经炎症，有效地减弱了慢性吗啡耐受性的发展。进而为缓解吗啡的耐受提供理论依据。本研究将会为减少吗啡副作用的发生和拓展吗啡在临床中的应用提供新的靶点和思路。 收起