摘要: 酚类有机物是一类具有苯环结构的高毒性环境污染物，也是生活饮用水水源和水产品中的潜在危害物，可通过食物链向生物体迁移和富集，进而威胁食品安全和人类健康。真菌漆酶作为一种多功能的生物催化剂，在有机酚污染物处理领域因具有绿色高效的优势而... 展开 酚类有机物是一类具有苯环结构的高毒性环境污染物，也是生活饮用水水源和水产品中的潜在危害物，可通过食物链向生物体迁移和富集，进而威胁食品安全和人类健康。真菌漆酶作为一种多功能的生物催化剂，在有机酚污染物处理领域因具有绿色高效的优势而备受关注。然而，目前漆酶制剂仍面临生产效率较低和成本较高的问题，制约了其工业化应用和发展，亟需开发低成本高效生产优质漆酶的方法。本研究筛选了一株高产漆酶的白腐真菌，优化了其产漆酶条件，探究了其胞外漆酶的酶学性质，并研究了漆酶对水中酚类有机物的去除效果和催化机理。主要研究内容和结果如下： （1）一株高产漆酶粗毛革孔菌的筛选及其产酶条件优化。以愈创木酚为底物，从自然环境中筛选高产漆酶真菌，探究廉价农副产物作为液态发酵产漆酶培养基碳源和氮源的可行性，并进一步优化培养基碳氮比、初始pH值和诱导剂等条件，以提高漆酶生产水平。结果表明，成功筛选到一株高产漆酶的粗毛革孔菌（Coriolopsisgallica）NCULACF1，其在含愈创木酚的马铃薯葡萄糖水（PDB）培养基中液态发酵12d所产漆酶的活力为0.73U/mL，是糙皮侧耳的1.78倍。优化结果表明，柚皮粉和麸皮富含多种营养物质和天然芳香诱导物，比精细商品碳氮源对促进真菌生长和漆酶生产具有更为显著的效果，分别为最佳碳源和氮源；最佳碳氮比和初始pH值分别为16∶1和5.0；2,6-二甲基苯酚（0.2mmol/L）和硫酸铜（1.0mmol/L）对漆酶表达具有显著的协同诱导作用，为最佳诱导剂组合。经过优化，漆酶活力（11.29U/mL）提高了14.47倍，发酵时间（5d）缩短了7d，表明利用粗毛革孔菌液态发酵柚皮粉和麸皮生产漆酶是一种高效、经济、可行的策略。 （2）粗毛革孔菌胞外漆酶的分离纯化和酶学特性表征。采用硫酸铵沉淀、弱阴离子交换层析（DEAE-琼脂糖凝胶FF）和凝胶过滤（葡聚糖凝胶G-75）对胞外漆酶进行3步提纯，并通过电泳法和紫外-可见吸收光谱法分析纯化漆酶的生物化学特征，进一步以2,2''-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）为底物探究漆酶的酶学性质。结果表明，经过3步纯化，胞外漆酶的最终比酶活为188.79U/mg，纯化倍数为6.13倍，酶活回收率为45.64%；漆酶的相对分子质量为57kDa，具有黄色漆酶的光谱特性；漆酶在60℃和pH2.5条件下最活跃，并在40~60℃和pH6.0~8.0范围内具有良好的稳定性；除了Cu2+和Pb2+，K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Cd2+、Ba2+均可激活漆酶活性；漆酶对甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜和乙腈等有机溶剂以及SDS、EDTA等部分化学抑制剂具有较高的耐受性，表明漆酶具有良好的工业应用潜力。 （3）漆酶对不同类型酚类有机物（苯酚、对氯苯酚和双酚A）的去除作用及催化机理研究。探究了底物浓度、温度、pH、加酶量和酚类型等因素对酶促去除水中酚类污染物的影响，并通过红外吸收光谱和高分辨率质谱技术表征酶促催化产物，进一步结合分子对接探究漆酶对酚类有机物的催化机理。结果表明，漆酶去除苯酚过程遵循Michaelis-Menten模型，其动力学参数km和Vmax分别为52.45mg/L和181.82mg/(L·h)；最佳去除条件为70℃、pH6.0和5.0U/mL酶量；漆酶对水中苯酚、对氯苯酚和双酚A的去除率分别可达91.63%、94.93%和96.71%。漆酶催化苯酚、对氯苯酚和双酚A发生聚合反应，形成不溶性沉淀，其聚合产物的聚合度分别为2~8、2~5和2~4，基本结构单元的大小分别为92、126和226，由此说明酚单体相对分子质量越大，聚合度越低。分子对接结果表明，漆酶与不同酚类有机物底物之间的结合位点、结合能和主要结合驱动力（氢键和疏水相互作用）略有差异，进而影响了催化效率。该结果为利用漆酶更高效地催化去除酚类有机物提供了分子层面的理论依据。 收起