摘要: 木质素是一种高分子的聚合物，在自然界中的含量仅仅低于纤维素，作为苯丙烷的基本结构单元，其连接形式通过C-C键和C-O-C键相互连接，从而构成无规则的空间三维结构，因而在自然存在的状态下难以被降解。目前在利用微生物降解的同时，也使得能产生大... 展开 木质素是一种高分子的聚合物，在自然界中的含量仅仅低于纤维素，作为苯丙烷的基本结构单元，其连接形式通过C-C键和C-O-C键相互连接，从而构成无规则的空间三维结构，因而在自然存在的状态下难以被降解。目前在利用微生物降解的同时，也使得能产生大量的降解木质素的酶对木质素进行分解转化，不单单可以治理环境污染的问题，而且可以合理利用自然界中的木质素资源。 因此，利用合理的方法分离纯化木质素降解菌，探索产酶能力及发酵条件，构建高效表达漆酶基因工程菌并应用于生产实践显得尤为重要，这将大大加快木质素原料在工农业生产的利用步伐，同时也是制约环境污染的关键所在。 试验一高产漆酶菌株的筛选及鉴定 为了获得高产漆酶的菌株用于降解木质素，分别从新乡周边腐木堆积处、秸秆堆积处和造纸厂废水这些木质素含量丰富的地方取样。本研究以木质素为唯一碳源，初筛出42株对木质素具有降解能力的菌株，采用愈创木酚平板法对产漆酶的菌株进行复筛得到4株产漆酶能力较强的真菌菌株，通过生理生化及18SrDNA序列分析对菌株进行鉴定，确定了2号菌株为疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria），6号菌株为粗毛革孔菌（Coriolopsis gallica），8号菌株为黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium），11号菌株为白腐菌（White rot fungi）。并通过液态发酵培养及ABTS法对漆酶活性木质素降解能力进行研究。 试验二目的菌株产酶能力的比较及发酵条件的探索研究 挑取筛选出来的四种真菌菌株于液体培养基中，制备粗酶液，并利用ABTS法每天测定上清液中的酶活力。试验表明，在经过培养6天后，8号菌株漆酶活力达到最高，为233.33U/L。接下来以黄孢原毛平革菌为目的菌株为研究对象，利用液态发酵研究碳源、氮源、金属离子、pH、温度对其发酵产漆酶的影响，优化产酶条件。结果表明:该菌株的最优碳源为乳糖，最优氮源为酵母粉，最适铜离子浓度为0.6mmol/L，最适温度为30℃，最适pH为4。在此条件下木质素去除率达到了84.7％，具有良好的降解木质素的能力，为进一步利用此菌株进行工业化生产奠定了基础。 试验三黄孢原毛平革菌漆酶基因的克隆表达及蛋白的纯化 为了获得高产漆酶的工程菌株，根据目前已知的黄孢原毛平革菌中的漆酶基因序列，设计特异性的引物，通过PCR扩增，可以成功的获得cds区为1680bp片段，送生工测序后对比发现此基因的序列与目前已公布的漆酶基因片段的同源性达98％，这就表明我们成功克隆到了该基因，将其命名为lac1680。在漆酶基因两段引入NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，将切下来的漆酶基因，通过pET-24a载体进行连接转化到大肠杆菌原核菌株中，得到基因工程菌。将我们得到的漆酶的氨基酸序列和GeneBank中现有的真菌漆酶氨基酸序列对比分析表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的序列同源性;通过对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE，出现75KDa目的条带，表明诱导表达成功;预表达成功后，通过收菌，破碎，上样流出液进行NI-NTA的层析柱，对纯化洗脱下来的mcol-c-His6蛋白进行纯化;为了更进一步的验证这个条带就是所需的漆酶条带，我们通过WesternBlot方法，洗脱纯化后和浓缩后的溶液中在目的位置都出现了75KDa的目的条带，证明这个条带就是诱导纯化后的漆酶。并经纯化回收后，漆酶纯度在98％以上。通过酶学性质的探究，对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌培养不同时间酶活力的比较，构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高，提高了39％，为进一步利用工程菌株进行工业化生产奠定了基础，也为以后的应用指明了方向。 收起