摘要: 漆酶是一种木质素降解酶，在生物质能源和清洁造纸等领域都具有重要的价值。野生菌漆酶产量低是目前阻碍漆酶大规模生产和应用的主要问题之一。本实验室对野生粗毛革孔菌(Coriolopsis gallica)进行紫外线和亚硝基胍联合诱变，获得一株漆酶活力显著提高... 展开 漆酶是一种木质素降解酶，在生物质能源和清洁造纸等领域都具有重要的价值。野生菌漆酶产量低是目前阻碍漆酶大规模生产和应用的主要问题之一。本实验室对野生粗毛革孔菌(Coriolopsis gallica)进行紫外线和亚硝基胍联合诱变，获得一株漆酶活力显著提高且稳定遗传的诱变粗毛革孔菌T906(Coriolopsis gallica T906)，在优化条件下诱变菌T906漆酶活力为野生菌的3倍多，可达303 U/mL，(以ABTS为底物)。 本论文以探索诱变菌漆酶活力大幅提高的分子调控机理为目的，对野生菌及诱变菌的生理生化和形态特征进行比较，并以漆酶同工酶分析为切入点，查找起主要作用的漆酶同工酶，从DNA、转录和蛋白质水平对两菌的分子遗传差异进行全面分析，获得以下结果： (1)诱变菌PDA平板培养特征、菌丝体光学显微镜观察、子实体石蜡切片及扫描电镜观察的形态都发生较大变化。两菌菌落和菌丝体显微形态各异，野生菌在PDA平板生长旺盛，菌丝呈放射状向平板四周延伸，新生菌落较厚，具明显环纹，菌落边缘菌丝分布稀疏、分支少而短；而诱变菌在PDA平板上生长较缓慢，新老菌落厚度一致，表面菌丝聚集成颗粒状突起，无环纹，菌丝分支多且交织成紧密的网状，菌落边缘菌丝长度整齐。两菌的子实体形态也有很大区别。野生菌子实体具不规则菌管，担孢子着生于菌管内；诱变菌成熟的子实体表面菌丝聚集成簇，无明显菌管。 (2)野生菌和诱变菌各分泌3个漆酶同工酶，酶活力均随时间增加，但两菌漆酶活力存在明显差异。在对数生长期第5天至第7天期间酶活增幅最大，第9天之后到进入平台期。Lac1为两菌主要分泌的漆酶同工酶，诱变菌Lac1的产量明显高于野生菌，是诱变菌漆酶活性显著提高的主要原因。 (3)克隆野生菌和诱变菌主要漆酶同工酶Lac1的编码基因lac1，分析发现两者序列相同。荧光定量PCR显示在酶活增幅最大的第7天和第9天，诱变菌lac1基因的转录活力是野生菌的6倍多。Western杂交则揭示了在整个培养时期诱变菌Lac1的表达量均明显高于野生菌。综合分析上述结果得知，lac1基因的转录活性增强使得Lac1蛋白的表达量剧增，是导致诱变菌漆酶活力大幅提高的主要原因。采用染色体步移的方法克隆野生菌和诱变菌的lac1基因上游调控序列，分析发现两者完全相同，从而证实诱变菌lac1基因的顺式作用元件无变化，其转录活性的提高与转录因子有关。 (4)胞外蛋白的SDS-PAGE分析显示，诱变菌胞外液含有一个大分子量的差异蛋白，其表达量随培养时间而增加，且明显高于野生菌，经鉴定为另一漆酶同工酶。该蛋白分子量大于97 kD，与毛栓菌(Trametes trogii)蓝色漆酶(Blue Laccase)同源，在胞外液中所占比例比Lac1小，但分泌量随时间的变化规律与Lac1相同。对该漆酶蛋白编码基因的克隆及表达调控的分析是下一步开展工作的起点，是诱变菌漆酶活性提高的另一有力证据，也是研究漆酶同工酶转录因子或相关代谢途径的另一切入点。 (5)利用双向电泳分离野生及诱变菌胞内总蛋白，选取表达量差异较大的蛋白点进行MALDI-TOF/TOF MS鉴定，结果表明差异蛋白与转录调控、信号传导和跨膜运输相关。其中，热激蛋白与漆酶基因的转录负调控机制相关，在诱变菌中表达量明显下调。 (6)对所克隆的粗毛革孔菌lac1基因及其cDNA进行序列分析，结果表明lac1基因长2140 bp，由11个外显子及10个内含子组成，内含子长度为51～76 bp，外显子共1554 bp，编码517个氨基酸组成的多肽，预测前21个氨基酸为信号序列，成熟的蛋白含496个氨基酸，理论分子量和等电点为53.18 kD和pI4.82，具4个铜离子结合位点、2个N-糖基化位点和3个Cu-oxidase保守结构域，丙氨酸含量高达10％。 (7)对lac1基因上游4553 bp的调控序列进行启动子预测，结果显示该序列存在3个启动子区，含有3个TATA框、7个典型的MREs以及一些重要的转录因子结合位点，如T-Ag、SIF、AP-2、SP1、MBF-I、UCE.2、SRF、TFIID和myosin-specific等。此外，lac1基因上游调控序列的甲基化程度很高，具有8个CpG岛，CpG岛的大量存在与漆酶同工酶Lac1的大量表达相关。 (8)优化了粗毛革孔菌的原生质体游离条件，使其原生质体得率稳定在106～107个/mL。采用PEG介导的方式将烟草花叶病毒35S启动子驱动的GFP绿色荧光蛋白基因转化进入粗毛革孔菌原生质体，构建了粗毛革孔菌的瞬时表达体系，同时证明35S启动子能被粗毛革孔菌正确识别。为下一步漆酶基因启动子的验证工作和内源基因功能的研究奠定了基础。 本论文着重对诱变菌漆酶活力提高的分子机理进行研究，最终将目标锁定在诱变菌漆酶基因的转录因子或相关代谢途径上，对进一步提高菌体漆酶活力以及探索漆酶的表达调控和相关代谢途径具有重要意义。 收起