摘要: 研究背景与目的 胃癌（gastriccancer，GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其全球发病率居第5位，死亡率居第3位。我国是胃癌高发病区之一，每年新发例数约40万例，总体死亡率呈逐年上升趋势。并且由于多数胃癌患者早期症状不典型、无特异性，确诊... 展开 研究背景与目的 胃癌（gastriccancer，GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其全球发病率居第5位，死亡率居第3位。我国是胃癌高发病区之一，每年新发例数约40万例，总体死亡率呈逐年上升趋势。并且由于多数胃癌患者早期症状不典型、无特异性，确诊时已处于中晚期，即进展期胃癌，临床疗效欠佳，预后差，5年生存率低，严重危害国人身体健康。化疗是目前胃癌常见的治疗方式，但由于化疗药物副作用大、不良反应多以及肿瘤耐药率高等问题，限制了其在胃癌治疗中的应用。因此，开发新型化疗药物，寻求有效联合治疗方案，以期改善当前胃癌治疗现状尤为重要。 近年来，毛琅科植物黑种草籽越来越受到人们重视。其药用价值高，从其提取的多种生物学物质，具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗菌、抗肿瘤等活性。而百里醌（Thymoquinone，TQ），就是从黑种草籽中提取并纯化的一种活性单体。多项研究证实，百里醌可参与调控多种肿瘤细胞的生物学行为，包括结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等，可显著抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，诱导肿瘤细胞凋亡。此外，百里醌在体外和体内实验均能增强5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）诱导结肠癌细胞凋亡的活性，还可增强常规化疗药物吉西他滨对胰腺癌的抗肿瘤作用，但具体作用机制不明。而顺铂是胃癌治疗的基础药物，通过干扰DNA修复，引起DNA损伤，进而诱导肿瘤细胞凋亡。但目前单用顺铂的疗效并不理想，经过顺铂治疗后复发的肿瘤患者耐药率高。多项研究发现，联合治疗（基于顺铂）的抗肿瘤疗效显著优于单用顺铂，包括卵巢癌、胃癌、食管癌、肺癌、胰腺癌等。因此，人们越来越重视顺铂联合治疗肿瘤策略在临床上的应用，以期改善肿瘤治疗现状。 PI3K/AKT信号通路是参与细胞增殖调控的重要通路之一，其在肿瘤的发生发展中常被异常地激活，是关键的“驱动因子”。该条通路由许多个亚单位和激酶组成的，因此为癌症的治疗提供了许多潜在的靶点。肿瘤抑癌基因PTEN（phosphataseandtensionhomlog，PTEN）基因于1997年首次被发现，其表达产物具有蛋白质磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性，可使PIP3去磷酸化成为无活性的PIP2，阻止AKT的活化，从而抑制了PI3K/AKT信号通路的激活，发挥其抑癌作用。在人类的多种恶性肿瘤中，广泛存在PTEN基因突变、缺失或者启动子超甲基化等发生。但目前关于PTEN基因在胃癌发生发展的作用研究甚少。研究表明，Wnt/β-catenin通路异常激活与肿瘤的侵袭和迁移能力密切相关，且GSK-3β作为该信号通路的重要负向调节因素，其活性可受到PI3K/AKT信号通路的密切调控。多项研究证实，PI3K/AKT信号通路活性改变在百里醌抗肿瘤过程中发挥了重要作用。百里醌可通过靶向PI3K/AKT信号通路，改善肿瘤耐药细胞对阿霉素和多西他赛的敏感性。本课题组前期研究已证实，百里醌可在体内外抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞发生凋亡。我们推测，百里醌可能通过上调PTEN基因调节PI3K/AKT信号通路活性，实现增强胃癌细胞对顺铂敏感性作用，并且，PTEN基因很可能在胃癌的侵袭和迁移过程中发挥了重要作用。 因此，本课题在前期研究基础上，进一步研究百里醌联合顺铂对胃癌细胞生物学行为的影响，同时探索了PTEN基因调控胃癌的发生发展的作用机制，在动物水平也证实了百里醌和顺铂的抗胃癌作用。第一部分，运用百里醌和顺铂处理人胃癌细胞系(HGC-27、SGC-7901、MGC-803)，检测两者对胃癌增殖和凋亡的影响，通过CCK-8、克隆形成、Hoechst33258染色法、流式凋亡染色及Westernblot等方法，同时构建了稳定转染的胃癌细胞系，探究百里醌对胃癌细胞对顺铂的敏感性的影响及作用机制；第二部分，进一步探讨了PTEN基因调控胃癌细胞侵袭和迁移的具体机制；第三部分，通过构建裸鼠胃癌皮下移殖瘤体内实验模型，予以裸鼠腹腔注射百里醌和顺铂，探讨两者联合治疗在裸鼠体内对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。 材料与方法 1、选取人胃癌细胞系(HGC-27、SGC-7901、MGC-803)为研究对象，分别不同浓度的百里醌（0、5、10、20、40、80μM）和/或顺铂（0、0.25、0.5、1、2、4μg/mL）处理人胃癌细胞24h，通过CCK-8法检测百里醌和/或顺铂对人胃癌细胞增殖能力的影响，用GrahPad软件计算两种药物对胃癌细胞增殖抑制率和药物的IC50，用calcusyn2.0软件分析百里醌和顺铂是否协同抑制胃癌细胞增殖；以终浓度为空白、5μM百里醌、2μg/ml顺铂、5μM百里醌+2μg/ml顺铂作用于人胃癌细胞24h，运用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术、及Hochest33258染色等方法检测百里醌和顺铂对胃癌细胞增殖和凋亡的影响；百里醌和顺铂刺激胃癌细胞24h后，westernblot检测细胞内PTEN、p-AKT、AKT、P-gp、Bax、Bcl-2、CytC、AIF等蛋白变化。 2、构建敲低PTEN的稳定细胞系，干扰胃癌细胞PTEN的表达后，予以该细胞系百里醌和顺铂刺激，运用CCK-8、克隆形成、Hoechst33258凋亡染色及westernblot验证百里醌是否通过上调PTEN基因，增强胃癌细胞对顺铂的敏感协同发挥抗胃癌的作用。 3、购置胃癌组织芯片（含48例胃癌患者的癌与癌旁组织标本），采用免疫组化法检测PTEN和β-catenin蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达，研究其与胃癌患者临床病理学特征的关系，进一步进行两者表达在胃癌组织中的相关性分析；以胃癌细胞系HGC-27和SGC-7901为研究对象，构建稳转细胞系，敲低PTEN基因的表达，通过划痕实验、Matrigel侵袭试验研究PTEN基因在调控胃癌侵袭和迁移中的作用；通过PTEN和β-catenin免疫荧光染色，westernblot检测PTEN、AKT、p-AKT,、p-GSK-3β、β-catenin、E-cadherin等蛋白表达差异，最后用明胶酶谱法分析干扰胃癌细胞PTEN基因表达后胃癌细胞MMP-2和MMP-9的活性变化。 4、选取人胃癌SGC-7901细胞系，PBS重悬细胞调整细胞浓度4×107/mL，接种至裸鼠后背部皮下（每只裸鼠接种体积100μL），构建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型后，将裸鼠随机进行分组，腹腔注射生理盐水、顺铂、百里醌以及百里醌和顺铂联合，观察裸鼠状态和瘤体的生长情况并做好记录，间隔2天给药，给药10次后，去眼球取血，离心取上清检测裸鼠肝肾功能，断颈椎处死裸鼠，分离剥除皮下移植瘤，称瘤体重量，取裸鼠肝脏、脾脏、脑以及肺组织行HE染色，并绘制瘤体生长曲线、TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况、免疫组织化学方法检测PTEN蛋白的表达变化。 结果 1、用梯度浓度的百里醌（0、5、10、20、40、80μM）刺激胃癌细胞系（SGC-7901、HGC-27和MGC-803）24h，CCK-8检测发现，百里醌可抑制胃癌细胞增殖，且呈浓度依赖性。 三种胃癌细胞系中，SGC-7901对百里醌最敏感。在百里醌浓度为5μM时，对3种胃癌细胞无明显的细胞毒性作用，细胞存活率约为90%，故而选择该浓度进行预处理。百里醌（5μM）预处理的胃癌细胞后，予以顺铂(0、0.25、0.5、1、2、4μg/mL)刺激24h，百里醌和顺铂联合组抑制胃癌细胞活力的IC50值显著低于单用顺铂组，差异有统计学意义（P＜0.05）。运用Calcusyn2.0软件分析联合指数（cmbinationindex，CI）提示百里醌和顺铂具有协同抑制胃癌细胞增殖的作用。克隆形成实验中，克隆形成数空白组169.3±10.6，百里醌组126.3±11.6，顺铂组120.0±3.6，联合组49±6.9，提示联合组可显著抑制胃癌细胞克隆形成（P＜0.05）。在Hoechst33258染色实验中，两个单药组诱导的细胞凋亡率明显高于对照组(P＜0.05)，同时我们发现，联合处理组诱导凋亡的细胞比例高于任一单药组（P＜0.05）。流式PE/7-AAD细胞凋亡染色结果显示，早、晚期凋亡率与对照组(1.77%和5.23%)、TQ(3.47%和9.58%)、顺铂(11.24%和22.15%)相比，联合处理组的SGC-7901细胞早、晚期凋亡率明显升高，分别为19.15%和63.5%。Westernblot结果示，与对照组相比，随着百里醌浓度升高，PTEN蛋白表达逐渐升高，AKT蛋白表达无差异，但p-AKT，P-gp表达明显下降；进一步的，与单药组相比，联合处理组PTEN蛋白表达显著升高，p-AKT和P-gp表达明显下降，凋亡相关蛋白Bax、CytC、AIF、cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-7、cleavedcaspase-9等表达显著升高，但抗凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-3、procaspase-7和procaspase-9等表达明显下降（P＜0.05）。上述一些列研究结果表明，百里醌可能通过上调PTEN基因负向调控AKT信号通路从而实现在体外与顺铂协同发挥抗胃癌的作用。 2、构建敲低PTEN基因表达的胃癌细胞系SGC-7901/HGC-27/MGC-803-PTEN-shRNA，并设立空白对照SGC-7901/HGC-27/MGC-803-NC，检测予以顺铂和/或百里醌刺激。CCK-8实验中，单用顺铂刺激细胞发现，与对照组相比，干扰PTEN表达的胃癌细胞对顺铂的敏感性降低，同一顺铂浓度刺激下，后者细胞活力更高；同样地，联合组刺激细胞发现，与对照组相比，干扰PTEN表达胃癌细胞对药物刺激的敏感性降低，同一药物刺激下，后者细胞活力更好。克隆形成实验发现，敲低PTEN基因，联合组细胞克隆形成率升高（P＜0.05）。Hoechst33258染色结果示：联合组刺激胃癌细胞24h，我们发现干扰PTEN表达后细胞的凋亡率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。Westernblot实验中，与阴性对照组相比，敲低PTEN，顺铂和联合组p-AKT蛋白水平升高，P-gp蛋白表达降低，而Baxcleavedcaspase3cleavedcaspase9等凋亡蛋白显著水平降低，差异均有统计学意义。上述实验结果表明，百里醌能增强胃癌细胞对顺铂的敏感性，而敲低PTEN表达，能减弱百里醌的这种作用。 3、免疫组化结果显示，PTEN在大多数胃癌组织中的低表达，且与胃癌患者的分化程度密切相关。进一步分析发现，胃癌组织中PTEN与β-catenin蛋白表达呈负相关(r=-0.546，P＜0.01)。此外，划痕实验及Transwell小室侵袭实验显示，敲除PTEN基因表达，促进了胃癌细胞的迁移和侵袭，westenblot检测发现，干扰PTEN表达，胃癌细胞的p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin、E-cadherin、MMP-7、MMP-2和MMP-9蛋白表达上调，明胶酶谱实验提示干扰PTEN表达，人胃癌细胞MMP-2和MMP-9活性升高。 4、裸鼠胃癌细胞皮下移植瘤体内实验中，24只裸鼠成功构建皮下移植瘤模型，随机分为四组，予以腹腔注射药物，分别为对照组、顺铂组、百里醌组、百里醌和顺铂联合用药组。移植瘤逐渐生长，待给药结束，处死动物并取材，剥离瘤体测量其长径和短径，计算瘤体体积为（以上四组依次）：1214.92±207.99mm3，845.01±53.09mm3，582.49±75.43mm3，345.99±54.83mm3，提示与单药组相比，联合组可显著抑制瘤体生长，差异有统计学意义(P＜0.05)。瘤体重量：联合组对肿瘤生长有更强的抑制作用，肿瘤重量显著低于单药组(P＜05)。进一步TUNEL检测发现：联合组凋亡率显著增高（P＜0.05）。免疫组化结果显示，联合组PTEN蛋白表达水平升高，且高于单药组。上述裸鼠体内实验结果表明：百里醌能上调P 收起