摘要: 第一部分TSPAN8在非酒精性脂肪性肝病动物及细胞模型中的表达 目的：构建非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）动物模型及细胞模型，检测四跨膜蛋白8（TSPAN8）在NAFLD动物肝脏及细胞中的表达情况。 方法：将30只雄性小鼠（C57BL/6J，6-8周龄，体质量18... 展开 第一部分TSPAN8在非酒精性脂肪性肝病动物及细胞模型中的表达 目的：构建非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）动物模型及细胞模型，检测四跨膜蛋白8（TSPAN8）在NAFLD动物肝脏及细胞中的表达情况。 方法：将30只雄性小鼠（C57BL/6J，6-8周龄，体质量18.9±2.77g）随机分为两组，每组15只，普通饲料组(ND)和高脂饲料组(HFD)。在喂养的1、3、6月末分别随机处死HFD组和ND组小鼠各5只并收集其肝脏组织和血清样本。组织病理学（HE）染色评估造模情况，全自动生化仪检测小鼠血清甘油三酯（TG）含量，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法和蛋白免疫印迹（Westernblot）法检测小鼠肝组织中TSPAN8基因表达情况。将HepG2细胞随机分为对照（CON）组和模型（FFA）组。FFA组由终浓度为1mmol/L游离脂肪酸（FFA）处理HepG2细胞24小时构建NAFLD模型。油红O染色法和细胞内TG含量检测评估细胞模型情况。细胞中TSPAN8的表达情况通过qRT-PCR法和Westernblot法检测。 结果：6月末小鼠肝脏病理切片显示HFD组NAFLD小鼠模型构建成功；与相同喂养时间ND组相比较，3、6月末HFD组小鼠血清中的TG含量增加（Plt;0.05）；qRT-PCR和Westernblot结果均显示与同喂养时期ND组相比，1月末HFD组小鼠肝组织中TSPAN8蛋白表达水平未见明显变化（P＞0.05），3、6月末HFD组小鼠肝组织TSPAN8表达水平降低（P＜0.05），与1月末HFD组相比，3、6月末小鼠肝组织TSPAN8表达水平降低（P＜0.05）；油红O染色法和细胞内TG含量检测示，与CON组相比，FFA组细胞内TG含量增加（P＜0.001）；qRT-PCR与Westernblot结果均显示，与CON组相比较，FFA组细胞内TSPAN8表达水平降低（P＜0.01）。 结论：NAFLD动物和细胞模型构建成功，TSPAN8在NAFLD动物肝脏中和细胞中的表达量均降低，提示该基因与NAFLD之间可能有着密切关系，但该基因的变化具体影响NAFLD的哪一方面，需要进一步的研究。 第二部分TSPAN8对非酒精性脂肪性肝病肝脂代谢影响的体外研究 目的：探索TSPAN8在HepG2细胞中过表达和干扰后，对肝细胞脂代谢的影响及引起这种现象可能的相关机制。 方法：将HepG2细胞先随机分为4组：TSPAN8质粒过表达（PCDNA-TSPAN8）组，其对照为PCDNA3.1组；TSPAN8干扰（siTSPAN8）组，其对照为siNS组；用qRT-PCR法验证TSPAN8是否转染成功；再将HepG2细胞随机分为4组：先分别行以上四组处理，再各加入终浓度为1mmol/LFFA处理24h，分别命名为PCDNA-TSPAN8+FFA组、PCDNA3.1+FFA组、siTSPAN8+FFA组和siNS+FFA组；油红O染色法测定HepG2细胞内脂质积累情况，全自动生化仪检测细胞内TG含量；用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测以下与肝脏脂质代谢相关基因mRNA的表达情况：酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）、超氧化物歧化酶（SCD）、脂肪酸结合蛋白1（FABP1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、脂肪酸转运蛋白5（FATP5）。 结果：qRT-PCR检测结果示，与PCDNA3.1组相比，PCDNA-TSPAN8组中TSPAN8表达升高（P＜0.001），与siNS组相比，TSPAN8在siTSPAN8组中表达下降（P＜0.001）；油红O染色法与细胞内TG含量检测示，与PCDNA3.1+FFA组比较,PCDNA-TSPAN8+FFA组细胞内脂质堆积减少，细胞内TG水平下降（P＜0.001）；相反，与siNS+FFA组比较，siTSPAN8+FFA组细胞内脂质堆积增加，细胞内TG水平增加（P＜0.001）；qRT-PCR结果示，与PCDNA3.1组比较，FATP5在PCDNA-TSPAN8组中表达明显下降(P＜0.01)，而与CON组比较，FATP5在FFA组表达升高(P＜0.001)，而与FFA组相比，FATP5在Ad-TSPAN8+FFA组表达下降(P＜0.001)。 结论：TSPAN8基因在HepG2细胞中成功过表达和干扰，TSPAN8的过表达和干扰参与体外肝细胞脂代谢调控，这种调控作用可能是通过影响下游基因FATP5实现的。 收起