摘要: 第一部分：NPRL2在前列腺癌中的表达及预后价值的生物信息学分析 目的：利用公共数据库对前列腺癌中NPRL2基因进行生物信息学分析。 方法：使用UCSCXena浏览器检索来自癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）-前列腺腺癌（Prostateadeno... 展开 第一部分：NPRL2在前列腺癌中的表达及预后价值的生物信息学分析 目的：利用公共数据库对前列腺癌中NPRL2基因进行生物信息学分析。 方法：使用UCSCXena浏览器检索来自癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）-前列腺腺癌（Prostateadenocarcinoma，PRAD）和正常组织数据库（Genotype-TissueExpression,GTEx）-正常前列腺组织（normalprostate）的RNA-SEQ数据及其临床数据，分析NRPL2在前列腺癌中的表达情况及对患者预后的影响，绘制NPRL2在前列腺癌中的ROC曲线，并在前列腺癌组织芯片中行免疫组织化学检查。 结果：通过比较TCGA-PRAD和GTEx-normal中NPRL2基因的转录谱特征，结果显示NPRL2基因编码蛋白的转录产物ENST00000232501.7只占正常前列腺组织总转录物的20%左右,然而，在前列腺癌组织与癌旁组织中，这一比例急剧上升到60%以上。此外，研究结果还证实了该转录本在前列腺癌中的绝对表达量（log2(TPM+0.001)）明显更高。取NPRL2中位表达值作为截点，发现NPRL2高表达组的疾病特异性生存期（DiseaseFreeSurvival,DSS）和总生存期（OverallSurvival，OS）明显短于NPRL2低表达组（P值分别为0.034和0.021）。NPRL2高表达组患者无进展生存期（ProgressionFreeSurvival,PFS）有缩短，但差异无统计学意义（p=0.71)。本课题组还通过TCGA数据库数据绘制了NPRL2在前列腺癌中的ROC曲线，在预测Normal和Tumor结局上，NPRL2的预测能力有一定的准确性（AUC=0.759，CI=0.695-0.822）。最后，在前列腺癌组织芯片中进行免疫组织化学染色，从蛋白水平上验证NPRL2的表达，也发现了类似的结果，即NPRL2在前列腺癌中高表达。 结论：NPRL2的典型蛋白编码亚型(ENST00000232501.7)在前列腺癌组织中明显上调，且与前列腺癌患者的不良预后相关。NPRL2可能在前列腺癌的发生、发展中起到了重要的生物学作用。 第二部分NPRL2影响去势抵抗性前列腺癌对尼拉帕利敏感性的研究 目的：探究NPRL2是否影响去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistantprostatecancer,CRPC）对尼拉帕利（Niraparib）敏感性。 方法：以NPRL2表达中位数为界值，对TCGA中原发性前列腺癌患者进行基因富集分析（GSEA）。通过慢病毒感染构建沉默NPRL2的CRPC细胞系，qRT-PCR和Westernblot的方法验证其敲减效率。采用CCK-8比色法检测尼拉帕利是否有剂量依赖的细胞毒性。进一步的用流式细胞计数检测细胞凋亡情况。此外，用Westernblot检测沉默NPRL2的CRPC细胞中经尼拉帕利处理后凋亡相关蛋白（Cleavedcaspase-3蛋白、Bcl-2蛋白和Bax蛋白）的表达变化情况。 结果:NPRL2表达的GSEA发现，高NPRL2表达组在“DNArepair”和“oxidativephosphorylation”这两个基因集中显著富集（Plt;0.05）。qRT-PCR和Westernblot结果显示成功构建沉默NPRL2的人前列腺癌PC3和DU145细胞株。CCK-8比色法检测结果发现在同样浓度的尼拉帕利处理下，沉默NPRL2的PC3和DU145细胞的存活率显著降低。流式细胞计数的结果显示用尼拉帕利（100nM）或DMSO处理PC3和DU145细胞后，沉默NPRL2增加了尼拉帕利促PC3细胞和DU145细胞的凋亡。Westernblot结果显示，沉默NPRL2的PC3细胞和DU145细胞经尼拉帕利处理后，半胱天冬酶-3(Cleavedcaspase-3)和Bax(仅在PC3中，DU145缺乏Bax)的蛋白表达水平高于对照组，而Bcl2的蛋白表达水平低于对照组。 结论：NPRL2影响了CRPC细胞对尼拉帕利的敏感性。 第三部分NPRL2影响去势抵抗性前列腺癌对尼拉帕利敏感性的机制研究 目的：探究NPRL2影响去势抵抗性前列腺癌对尼拉帕利敏感性的机制。 方法:通过使用GeneMANIA（http://genemania.org/）网站构建了以NPRL2为中心的基因-基因功能相互作用网络。发现NPRL2可能与UBE2M有功能关系。随后通过生物信息学分析、细胞免疫荧光实验、免疫组化检查、免疫共沉淀实验、MG132和放线菌酮（CHX）实验、泛素化实验和裸鼠动物模型等方法探究NPRL2影响去势抵抗性前列腺癌对尼拉帕利敏感性的机制。 结果：1、NPRL2为中心的基因-基因功能相互作用网络，发现NPRL2可能与UBE2M有功能关系。免疫荧光检查观察到NPRL2和UBE2M这两种蛋白在PC3和DU145细胞中存在共定位。此外，在前列腺癌组织芯片上进行免疫组化染色发现NPRL2和UBE2M在细胞核和细胞质中的定位相似。进一步的用免疫共沉淀实验证实NPRL2在PC3和DU145细胞中与UBE2M发生相互作用。通过MG132和放线菌酮（CHX）实验、泛素化实验，我们推测UBE2M可能通过减少NPRL2的多聚泛素化和蛋白酶体降解来稳定NPRL2，可能正是因为UBE2M使得NRPL2相对稳定的表达从而影响了CRPC细胞对尼拉帕利的敏感性。 2、通过CCK8比色法，流式细胞计数、Westernblot等实验结果显示UBE2M也影响了CRPC细胞对尼拉帕利的敏感性。在裸鼠移植瘤动物模型中沉默NPRL2或沉默UBE2M明显增强了尼拉帕利对裸鼠瘤体体积的生长的抑制作用、影响瘤体细胞的增殖并诱导凋亡。 3、通过Westernblot、流式细胞计数等实验结果表明NPRL2通过UBE2M增强Neddylation从而影响了CRPC细胞对尼拉帕利的敏感性。 结论：本研究发现了一种新的NPRL2-UBE2M复合物，可调节CRPC细胞对尼拉帕利的敏感性。因此，靶向NPRL2并阻断NPRL2途径可作为PARPI治疗的一种辅助策略。 收起