摘要: 第一部分NPRL2基因在前列腺癌组织中的生物信息学分析 目的：运用公共数据库对NPRL2基因进行大数据的生物信息学分析。 方法：主要参考TCGA和部分GEO数据库中的全转录组数据及临床信息，分析大数据中NPRL2在前列腺癌中的特征，并以TCGA数据库中... 展开 第一部分NPRL2基因在前列腺癌组织中的生物信息学分析 目的：运用公共数据库对NPRL2基因进行大数据的生物信息学分析。 方法：主要参考TCGA和部分GEO数据库中的全转录组数据及临床信息，分析大数据中NPRL2在前列腺癌中的特征，并以TCGA数据库中的样本进行GSEA富集分析。 结果：在TCGA数据库中，NPRL2在前列腺癌组织中的表达量不同于以往为抑癌基因的特点，其显著高表达。同时，我们运用两个GEO数据集（GSE68882和GSE6956）也发现了相似的结果。TCGA及GEO数据库是检测NPRL2的mRNA表达水平，进一步我们通过公共数据库中的免疫组化法检测结果发现了与TCGA等数据库中的相似结论，即蛋白水平也存在高表达。随后，将TCGA中485例有完整预后信息的前列腺癌患者进行了分析，以NPRL2的中位表达值分界，发现NPRL2高表达的患者预后更差。最后，我们运用TCGA的转录组数据，以NPRL2的高、低表达进行GSEA富集分析，发现NPRL2在前列腺癌中可能参与多种功能，如：阿尔兹海默症、帕金森病、小细胞肺癌、缝隙连接、肿瘤通路、WNT通路、ERBB通路、HEDGEHOG通路、脂肪酸代谢、肾上皮发育、腺体发生和线粒体蛋白复合物等。 结论：NPRL2在前列腺癌中的特点不同于既往对该基因的研究，结果甚至完全相反，表现为一个癌基因。且该基因可能参与了前列腺癌发生、发展中的多种生物学行为。 第二部分NPRL2基因转录水平调控的分子机制 目的：探究NPRL2基因的转录水平调控机制，寻找正向调控其表达的转录因子，揭示NPRL2基因在前列腺癌中高表达的机制。 方法：通过普通PCR、报告基因及转录因子预测软件等对NPRL2的上游序列进行分析，通过Westernblot、qPCR、双萤光素霉报告基因和染色质免疫共沉淀（ChIP）检测转录因子与NPRL2的结合情况。 结果：首先我们通过NCBI获取NPRL2转录起始上游-2000bp的序列，通过普通PCR构建NPRL2上游-2000bp启动子序列，并以-2000bp序列为基础构建不同长度的启动子序列。通过质粒装载，转染细胞后检测双萤光素霉报告基因的活性，发现-1500至-1100bp的启动子活性最强，并通过JASPAR预测了多个转录因子结合的位点，设计siRNA验证，发现沉默转录因子c-Jun时，NPRL2的mRNA及蛋白表达水平显著被抑制。随后双萤光素霉报告基因及ChIP证实c-Jun能与NPRL2的上游序列所结合，从而调控NPRL2的表达。分析GSE6956数据集发现c-Jun在前列腺癌中的表达显著高于正常组织。GSE68882数据集中NPRL2表达与c-Jun呈显著正相关，依据NPRL2和c-Jun的中位值在TCGA数据库中探讨了基因表达与前列腺癌患者预后的情况，发现NPRL2和c-Jun同时高表达的患者的无病生存和总生存均最差。 结论：转录因子c-Jun能在转录水平与NPRL2的上游启动子结合，从而促进NPRL2的表达。 第三部分NPRL2基因对前列腺癌细胞增殖功能的作用及机制 目的：研究NPRL2基因的沉默或过表达及上游调控分子c-Jun的沉默或过表达对前列腺癌细胞增殖功能的影响。 方法：采用分子生物学中常规检测细胞增殖、凋亡的实验验证NPRL2基因对前列腺癌细胞增殖活性的影响。同时，在沉默或过表达NPRL2的前提下增加沉默或过表达c-Jun，探讨c-Jun与NPRL2在功能上的相关性。 结果：CCK-8法发现NPRL2能够促进前列腺癌细胞的生长能力，克隆形成实验也发现了相似的结论。在细胞的凋亡维度，NPRL2发挥抗前列腺癌凋亡的作用，裸鼠成瘤实验发现沉默NPRL2的前列腺癌细胞系相比空白组细胞，瘤体更小且重量更轻。随后，在过表达和沉默NPRL2的基础上，增加了沉默及过表达c-Jun的组别，发现在前列腺癌细胞系PC3及LNCaP的细胞中，同时过表达c-Jun及NPRL2时，相较过表达NPRL2的同时沉默c-Jun组，细胞的生长显著加快，存活能力增强，细胞凋亡率降低，凋亡蛋白Caspase3（cleaved）、BAX的表达均降低。而同时沉默c-Jun及NPRL2时，细胞的增殖活性明显减弱，凋亡率显著增加，凋亡蛋白Caspase3（cleaved）、BAX的表达均显著升高。 结论：NPRL2基因在前列腺癌中发挥促增殖的作用，且该作用与c-Jun的参与有关，c-Jun能够增强NPRL2的这种促增殖作用。 第四部分NPRL2促进前列腺癌增殖的分子机制探讨 目的：探讨NPRL2通过何种机制在前列腺癌中发挥促增殖作用，为今后针对以NPRL2为靶点的治疗提供依据。 方法：通过转录组测序的方法分析沉默NPRL2的PC3细胞与空白组细胞的差异基因表达，并对差异基因进行KEGG通路分析，进而通过Westernblot检测通路分子在沉默或过表达NPRL2后的差异，在此基础上加入通路抑制剂再次验证通路分子的表达变化。 结果：首先我们通过转录组测序比较了沉默NPRL2与否的PC3的差异基因，发现它们富集最多的通路为PI3K/AKT，而该通路参与了多种肿瘤的促增殖作用，Westernblot结果显示，在前列腺癌细胞PC3及LNCaP中，沉默NPRL2时PI3K/AKT通路上的关键分子，p-AKT、p-MDM2均显著降低，而过表达NPRL2时，p-AKT、p-MDM2的表达显著升高，因为PC3细胞为p53天然阴性的细胞系，因此沉默和过表达NPRL2对PC3细胞中p53的表达无明显影响，而在LNCaP细胞系中，沉默和过表达NPRL2分别上调和下调p53的表达。随后，我们在过表达NPRL2组的前列腺癌细胞中加入了AKT的抑制剂MK2206，结果显示，加入MK2206后，即使过表达NPRL2，p-AKT、p-MDM2的表达均显著降低。同时，CCK-8实验提示加入MK2206的前列腺癌细胞细胞，即使过表达NPRL2，较空白组细胞的增殖活性显著降低。相较空白组，过表达NPRL2组的凋亡蛋白Caspase3（cleaved）和BAX显著降低，而过表达NPRL2的同时加入MK2206组的凋亡蛋白Caspase3（cleaved）和BAX表达则显著升高，BCL2的表达与Caspase3（cleaved）和BAX的表达变化相反。同时，NPRL2可能对CDK2存在调控作用，从而影响了AKT通路，而CDK2可能作为一个中间效应分子介导了NPRL2对AKT/MDM2/p53通路的作用。 结论：NPRL2通过调控AKT/MDM2/p53通路进而促进前列腺癌细胞增殖。 第五部分前列腺癌自噬相关基因预后模型的构建与分析 目的：自噬相关基因可能在前列腺癌中参与了多种生物学功能，然而目前关于自噬相关基因的大数据生物信息学分析较少。通过分析自噬相关基因在前列腺癌中的表达差异及功能特点，构建自噬相关基因的预后模型，指导对患者预后的评估。 方法：首先，从人类自噬数据库获得了共234个自噬相关基因（ARG）的信息。然后，根据癌症基因组图谱（TCGA）数据库，在前列腺癌患者中鉴定出差异表达的ARG。进行单因素和多因素Cox回归分析以筛选核心预后ARG与前列腺癌患者总生存期（OS）和无病生存期（DFS）的关系，并建立了预后模型。最后，进一步分析了预后模型与临床病理参数之间的相关性，包括年龄，T分期，N分期和Gleason评分等。 结果：通过单因素和多因素Cox回归分析，总生存相关的预后模型是基于五个ARG（FAM215A，FDD，MYC，RHEB和ATG16L1）所构建的，并将前列腺癌患者按模型分为高风险和低风险组（HR=6.391，95％CI=1.581–25.840，Plt;0.001）。预测模型的受试者工作特性曲线下面积（AUC）为0.84。T3-4期和Gleason评分gt;7的前列腺癌患者OS相关的预测模型评分显著高于T1-2期患者（P=0.008），和Gleason评分≤7的患者（P=0.015）。此外，基于22种ARG（ULK2，NLRC4，MAPK1，ATG4D，MAPK3，ATG2A，ATG9B，FOXO1，PTEN，HDAC6，PRKN，HSPB8，P4HB，MAP2K7，MTOR，RHEB，TSC1，BIRC5，RGS19，RAB24，PTK6和NRG2）构建了DFS相关的预后模型，AUC为0.85（HR=7.407，95％CI=4.850-11.320，Plt;0.001），DFS相关的预后模型与前列腺癌患者T分期（Plt;0.001），N分期及Gleason评分（Plt;0.001）密切相关（P=0.001）。NPRL2基因与这些预后相关的自噬基因大多存在相关性，如MAPK1、FOX01、PRKN、HSPB8、ULK2、TSC1、MTOR等，可见NPRL2可能参与到了自噬的多个环节。 结论：本部分研究成功构建了前列腺癌中自噬相关基因的两套预测模型，分别预测患者的总生存和无病生存，针对这些预后相关核心的进一步研究可能为前列腺癌的诊断及治疗提供新的思路和依据。 收起