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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 背景:恶性黑色素瘤(简称恶黑)是一种来源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤,黑色素细胞由神经嵴产生并迁移至皮肤、葡萄膜、脑膜及粘膜,大多数黑色素细胞位于皮肤的表皮-真皮交界处。恶黑的发病率占所有皮肤癌的4%,其转移后的死亡率占据皮肤肿瘤的75%... 展开 背景:恶性黑色素瘤(简称恶黑)是一种来源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤,黑色素细胞由神经嵴产生并迁移至皮肤、葡萄膜、脑膜及粘膜,大多数黑色素细胞位于皮肤的表皮-真皮交界处。恶黑的发病率占所有皮肤癌的4%,其转移后的死亡率占据皮肤肿瘤的75%。然而,近几十年来,全球恶黑的发病率一直在以惊人的速度增长。未来恶黑的控制将面临巨大挑战。因此,识别恶黑的关键特异性生物标志物对于临床精准治疗具有至关重要的作用。 长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一类新型的非编码RNA,通常是指长度超过200个核苷酸的RNA转录本。此外,越来越多的研究表明LncRNA参与肿瘤的生物学过程,并在肿瘤演进的过程中作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用。SRA相似非编码RNA(SLNCR)是一种新发现的LncRNA,位于人类染色体17q24.3上。最新研究表明SLNCR1在多种肿瘤中异常表达,并促进肿瘤细胞的迁移、增殖和侵袭。然而,SLNCR1在恶性黑色素瘤的发展过程中具体的作用机制尚不明确。 目的:探索恶黑进展过程中差异表达分子,阐明其促进恶黑进展的机制,为恶黑的诊断和治疗提供一定的理论依据。 方法和结果:在本文中,通过两种机制探讨SLNCR1在恶黑发展中的作用。首先通过RNA原位杂交技术判断SLNCR1在细胞中的定位。结果显示SLNCR1主要位于细胞核内,少量存在于细胞质中,所以推断SLNCR1可能通过转录调控以及转录后调控(ceRNA)两种机制参与了恶黑的进展。本文对此展开了以下研究:1)转录调控作用。首先,以人恶黑组织为研究对象,进行RNA-seq测序分析,获取恶黑组织中差异表达的LncRNA。通过qPCR方法在恶黑组织及细胞系中验证其表达水平,选取具有显著性差异且表达水平较高的SLNCR1进行后续研究。进一步通过统计患者基本临床信息及病理信息,明确SLNCR1高表达与淋巴结转移和P53阳性相关。为了探究SLNCR1在恶黑发展中的功能,在恶黑细胞系中沉默了SLNCR1的表达,通过CCK8,结晶紫染色,划痕实验,Transwell实验,克隆形成实验发现SLNCR1的沉默抑制了细胞的增殖、迁移、侵袭,并抑制EMT现象的发生。其次,通过RNA-seq测序,网站预测及生信分析发现SLNCR1可能与转录因子SOX5相互作用,经过双荧光素酶报告基因实验验证,SLNCR1的沉默可以抑制SOX5的转录活性。再次,为了验证SOX5在恶黑进展过程中发挥的作用,通过qPCR及Western Blot实验验证SOX5在恶黑组织及细胞系中为高表达水平,通过CCK8,结晶紫染色,划痕实验,Transwell实验,克隆形成实验发现SOX5的沉默抑制细胞的增殖、迁移、和抑制EMT现象的发生。并且敲低SLNCR1后SOX5的表达水平降低。为了验证SLNCR1与SOX5相互作用调控恶黑的发展,本文在敲低SLNCR1基础上过表达SOX5后发现,SOX5的过表达有效逆转了SLNCR1诱导的增殖,迁移,和EMT。最后,为了验证SLNCR1在体内靶向结合SOX5调控恶黑的发展,本文建立了Balb/c裸鼠皮下成瘤模型,结果发现与NC组相比,sh-SLNCR1组小鼠皮下肿瘤体积明显减小,免疫组化表明体内SLNCR1的沉默抑制了SOX5,Ki67及Vimentin的表达,与体外实验结果相符。2)转录后调控机制(ceRNA)。首先,下载GEO数据库的恶黑数据(GSE20994,GSE25653,GSE34460,GSE61741),利用R语言的limma包对数据实行ID转换和数据分组,然后用pheatmap包分析分组数据中miRNA的差异表达,得到恶性黑色素瘤组织中差异表达的miRNA。结合文献阅读结果,选取10种miRNA进行后续实验,包括miR-214,miR-183,miR-455-5p,miR-146b-3p,miR-429,miR-10b,miR-200a,miR-211,miR-379,miR-132,在恶黑组织中通过qPCR方法检测了这几种miRNA的表达水平,结果发现只有miR-146b-3p在恶黑组织中为低表达,在敲减SLNCR1后miR-146b-3p的表达水平上升,进而推断SLNCR1可能对miR-146b-3p具有一定的负调节作用。 结论:长链非编码RNA SLNCR1通过靶向转录因子SOX5促进恶黑的EMT。MiR-146b-3p在恶黑组织中低表达,SLNCR1的沉默回复了miR-146b-3p的表达水平,SLNCR1可能通过竞争性结合miR-146b-3p参与恶黑的发生发展。 收起
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