摘要: 铝是地壳中最丰富的金属元素，同时也是土壤无机矿物的主要元素。当土壤pH＜5.0时，固定态的铝就转变为溶解的Al3+离子状态，微摩尔水平的Al3+在几分钟内即可对植物造成毒害，而且pH越低，铝的溶解性越大，对植物造成的毒害也越大。铝毒害诱导脂质氧化... 展开 铝是地壳中最丰富的金属元素，同时也是土壤无机矿物的主要元素。当土壤pH＜5.0时，固定态的铝就转变为溶解的Al3+离子状态，微摩尔水平的Al3+在几分钟内即可对植物造成毒害，而且pH越低，铝的溶解性越大，对植物造成的毒害也越大。铝毒害诱导脂质氧化物及过氧化物产物生成，影响细胞间物质运输，破坏根尖细胞的正常伸长和发育，进而抑制主根和侧根伸长。因此，铝毒害已成为影响作物产量的限制因素之一。大豆(Glycine max(L.)Merr.)是一种重要的经济作物，为人类提供优质蛋白和油脂。然而南方酸性土壤的铝毒害严重影响了大豆的产量。目前关于大豆耐铝毒基因及其耐铝毒机制的报道非常有限。因此，挖掘大豆中优异的耐铝基因并鉴定其功能，探索大豆耐铝毒的分子调控网络，将为大豆分子育种提供重要的基因资源和理论依据。 本研究采用前期鉴定的耐铝(KF)和感铝(GF)两个大豆品种为材料，通过芯片技术和生物信息学分析，鉴定了参与大豆耐铝毒相关的代谢通路及关键候选基因。利用qRT-PCR技术对关键耐铝毒候选基因的转录水平进行了验证，结合植物转基因技术及生理和表型测定，研究耐铝候选基因在铝毒胁迫下的功能。本文所获得研究结果如下: 1.铝毒胁迫对大豆耐感铝品种的影响 对幼苗期鉴定的耐铝品种KF和感铝品种GF进行铝处理，研究铝毒对大豆生物量及生理指标的影响。铝处理浓度随处理天数的推移呈梯度增加，达到20mM时，感铝品种GF的生物量（根部干重，地上部干重，株高等）受到显著抑制;生理指标如抗氧化物酶类（POD（Peroxidase）、SOD（Superoxide Dismutase）、CAT（Catalase）等）的含量在两个品种中均增加，但耐铝品种比感铝品种增加更显著;而细胞膜丙二醛(MDA)在感铝品种中显著增加。结果表明当铝浓度超过一定范围时，铝毒害会严重抑制感铝品种的生长，破坏生理调节，而耐铝品种会通过生理指标如POD、SOD、CAT等的调节来抵抗外界的胁迫，从而维持自身相对正常生长。 2.耐感铝大豆品种在铝毒胁迫下的基因表达谱分析 利用包含66473个大豆探针的Affymetrix的mRNA表达谱芯片对耐铝品种KF和铝敏感品种GF在对照（0μM AlCl3，pH=4.3）和铝处理（25μM AlCl3，pH=4.3）6、12和24小时后的根尖进行表达谱分析。根据“FDR(False Discovery Rate)≤0.05和log2FC(Fold Change)|≥1”两个阈值鉴定差异表达基因(Differentially Expressed Gene，DEG)。在铝处理6h后，耐、感品种DEGs的个数分别为1210和1394个，铝处理12h后耐感品种DEG个数分别为1846个和2916个，铝处理24h后，耐感品种DEGs的个数明显增加，分别为3741和6633个。用MAPMAN对24h的的DEGs进行代谢通路分析，发现铝胁迫下，参与糖酵解、三羧酸循环及GABA循环等代谢通路的基因表达在两个品种间有显著差异。进一步对这些DEGs进行筛选，发现1937个基因在耐铝品种比感铝品种显著上调。AgriGO网站分析发现这1937个基因中参与抗氧化物酶代谢的POD基因显著富集，且这些POD基因在耐铝品种中受铝毒诱导显著上调，但在感铝品种中下调表达或上调不显著。1937个基因的GO注释显示分布到38个功能类别中，主要包括细胞外区域、抗氧化剂、酶催化活性、转运体、代谢过程和刺激应答等功能类别。这1937个基因进行转录因子富集分析，发现WRKY，MYB，AP2等转录因子显著富集。通过qRT-PCR对15个基因进行表达分析，与芯片结果相关性为R2=0.766，表明两种方法比较一致。基于差异表达谱分析和生理指标（POD活性等）测定结果并结合相关文献报道，推测大豆耐铝性差异可能与一些关键代谢途径、抗氧化物酶、转录因子、有机酸分泌等相关，这些基因可作为重点耐铝候选基因进一步研究。 3.多药及毒性化合物外排转运MATE的全基因组鉴定和生物信息学分析 多药及毒性化合物外排转运（Multidrug and toxic compound extrusion，MATE）蛋白家族是多药排出转运体的重要成员，主要参与转运有机酸、植物激素、次级代谢物等有机化合物。然而，目前关于植物尤其是大豆MATE家族还鲜有报道。以MATE保守结构域的序列为条件，通过HMMER检索，同时以拟南芥中MATE基因的蛋白序列为参考序列，在Phytozome数据库中进行BlastP比对，发现大豆中共有117个MATE基因，根据其物理位置分别命名为GmMATE1-GmMATE117，分布在20条染色体上。进化分析显示大豆MATE基因分为4个亚家族10个小亚族，这与前人的研究结果一致。利用qRT-PCR技术研究MATE家族在大豆九个组织中的表达情况，结果表明这些基因在不同的亚家族中的组织表达模式差别很大。通过进化树分析和亚家族内已知功能的基因，推测亚族4中的第三个小亚组(C4-3)的8个GmMATE基因可能编码铝离子转运体。在PlantCAR数据库中对这8个基因上游启动子1500bp的序列进行顺式作用元件预测，发现有11个与胁迫相关的元件，包括激素响应ABRE(ABA-responsive element)、TCA-element，逆境响应ARE（响应厌氧元件）、HSE（热激响应元件）、LTR（低温响应元件）、WUN(创伤响应激元件)，及其他的CGTCA-motif、MBS(MYB binding site)、TC rich-repeats、TGACG-motif、W1-Box。此外，对耐铝毒相关转录因子ART1的DNA-Binding序列(GGNVS)进行了预测，发现这8个GmMATE基因都含有5个以上的GGNVS序列，说明这些基因有被耐铝转录因子ART1调控的可能性。检测这8个GmMATE基因在铝胁迫下的表达模式发现，GmMATE75在耐铝大豆品种受到铝毒胁迫6、12、24h时显著上调表达。 4.大豆耐铝相关基因MATE的功能研究 利用转基因拟南芥和大豆发状根对GmMATE75基因功能进行研究，结果显示在25μM的铝处理下，过表达GmMATE75基因的拟南芥根尖铝离子含量比突变体M（AtMATE-KD）和野生型(Col-0)的明显减少;主根、侧根及叶片受铝毒抑制的程度明显降低;同时根尖活性氧的含量明显减少，说明过表达GmMATE75提高了转基因拟南芥的耐铝性。与转空载的大豆发根相比，过表达GmMATE75基因的大豆阳性发根在铝处理后根尖铝离子含量减少，说明过表达GmMATE75提高了大豆的耐铝性。 收起