摘要: 全球和我国存在大面积的酸性土壤，而铝毒是酸性土壤上作物产量的一个主要限制因子，对植物的根造成损伤，从而降低粮食产量。大豆是酸性土壤上重要的豆科植物，不同大豆品种间存在明显的耐铝毒差异，目前已经初步明确大豆耐铝毒是受多基因控制的数量... 展开 全球和我国存在大面积的酸性土壤，而铝毒是酸性土壤上作物产量的一个主要限制因子，对植物的根造成损伤，从而降低粮食产量。大豆是酸性土壤上重要的豆科植物，不同大豆品种间存在明显的耐铝毒差异，目前已经初步明确大豆耐铝毒是受多基因控制的数量性状。因此了解我国栽培大豆种质资源耐铝毒的遗传变异特点、发掘耐铝毒大豆资源、与大豆耐铝毒显著关联的位点及候选基因对大豆耐铝毒育种非常重要。 本研究通过简单水培法对涵盖全国6大生态区的387份栽培大豆品种进行耐铝毒鉴定，利用基于酶切的简化基因组测序技术(RAD-seq)获得的全基因组高密度SNP标记进行关联分析，并对显著关联的位点进行耐铝毒候选基因的筛选。主要结果如下: 1.确定了一套适于大豆耐铝毒的筛选方法，在AlCl3浓度为25μM、基础溶液为0.5mM CaCl2、适应pH为4.3时，耐铝毒和对铝毒敏感的大豆品种表型(主根相对生长量，Relative Root Growth，RRG)差异较大且遗传率较高，可以作为筛选耐铝毒大豆资源的快速鉴定方法。通过对13份材料的进一步研究表明，根尖铝相对含量（苏木精染色深度）与主根相对生长量呈极显著负相关(r2=-0.97，P＜0.0001)，说明越耐铝的大豆品种根尖吸收的铝离子越少，主根生长受抑制越小，RRG越大;相反，对铝毒越敏感的大豆品种吸收的铝离子就越多，主根生长受抑制越明显，RRG越小。 2.用上述确定的方法对来自我国六个不同生态区的387份栽培大豆进行耐铝毒鉴定（两次生物学重复，每次重复对照组与处理组各6株），方差分析表明，两次生物学重复之间差异不显著(P＞0.05)，品种间差异极显著(P＜0.0001)。耐铝毒指标主根长相对生长量(RRG)均值在该群体的分布范围在0.12～1.03之间，呈正态分布，平均RRG为0.60，广义遗传率为90.01％。筛选出26份耐铝毒品种(RRG＞0.80)和26份对铝毒敏感的品种(RRG＜0.40)。耐铝毒指标主根长相对生长量(RRG)与大豆来源的生态区(r2=-0.03，P=0.55)和土壤pH(r2=0.01，P=0.83)之间没有相关性。RRG与对照组根生长量(Root Growth-control，RG-c)不相关(r2=0.01，P＞0.05)，与处理组根生长量(Root Growth-treatment，RG-t)极显著相关(r2=0.70，P＜0.01)。 3.通过RAD-seq，获得覆盖整个基因组的145558个SNP标记。选取最小等位基因频率(Minor Allele Frequency，MAF)大于0.05的70203个SNP标记进行群体结构和连锁不平衡（Linkage Disequilibrium，LD）分析，结果表明该自然群体可以分为四个亚群，连锁不平衡分析显示r2从最大值(0.68)降到一半时的距离是621kb。 4.利用70203个SNP标记(MAF＞0.05)对387份栽培大豆两次生物学重复的平均RG-c、RG-t和RRG分别进行全基因组关联分析(Genome-Wide Association study，GWAS)。用一般线性模型(General Linear Model，GLM，显著水平设定为P≤10-9)没有检测到与RG-c显著关联的位点，检测到51个与RG-t显著关联的位点，97个与RRG显著关联的位点。用混合线性模型(Mixed Linear Model，MLM，显著水平设定为P≤10-4)检测到10个与RG-c显著关联的位点，4个与RG-t显著关联的位点，19个与RRG显著关联的位点。考虑到所用群体较大，混合线性模型假阳性较低等因素，为了进一步检测稀有等位变异，又选取了MAF大于0.01的104914个SNP标记对RRG进行GWAS分析，结果检测到31个与大豆耐铝毒显著关联的SNP。对这31个SNP进行多住点模型检测，在GLM多位点模型中检测到6个与大豆耐铝毒显著相关(P＜0.05)的SNP;MLM多位点模型中检测到4个与大豆耐铝毒显著相关（P＜0.05）的SNP。在GLM多位点模型和MLM多位点模型中均检测到的SNP有三个，即Gm11_5374534、Gm03_3488621、Gm17_39638460。Gm17_39638460的MAF为0.37,且在多位点模型中与RG-t和RRG都显著关联(P＜0.01)，可作为耐铝毒位点的重点区段进行后续分析，在该住点上、下游100kb内的候选基因有16个，其中与耐逆相关的包括Glyma17g35580、Glyma17g35610、Glyma17g35620、Glyma17g35671和Glyma17g35720。 5.上述混合线性模型检测到的31个SNP位点上、下游100kb内与耐逆相关的候选基因共72个，在soybase网站中进行功能查找、分析，发现Gm18_7772667附近的基因Glyma18g09000是耐多药相关的蛋白基因，根据文献报道可能与耐铝毒相关。对该基因内部位于Gm18_7746350的SNP设计引物，转换为dCAPs标记，并在97份大豆品种中进行分析。结果显示该SNP在97份材料中与大豆耐铝毒没有显著相关性(P＞0.05)，可能由于选取的实验材料较少、选取的标记是无功能的SNP标记、该位点对表型的贡献率低等因素造成。 收起