摘要: 植物铝毒害是酸性土壤中限制作物产量的重要因子之一，在pH＜5或更低的酸性环境中铝以可溶性状态存在、积累抑制植物根的生长和功能。目前，土壤酸化日益严重，仅我国的酸性土壤约占全国土地总面积的21％。生产上通常应用石灰来缓解铝毒害，但既不经济... 展开 植物铝毒害是酸性土壤中限制作物产量的重要因子之一，在pH＜5或更低的酸性环境中铝以可溶性状态存在、积累抑制植物根的生长和功能。目前，土壤酸化日益严重，仅我国的酸性土壤约占全国土地总面积的21％。生产上通常应用石灰来缓解铝毒害，但既不经济又污染环境。因此，利用植物已具备的或经改良提高的抗/耐能力是既经济又环保的方法。关于铝对植物的毒性和植物的耐铝性研究已有许多报道，育种家试图在分子生物学水平上研究并筛选出抗性较强的植物以适应酸铝环境。但这一领域还有许多基础理论研究需进一步深入。到目前为止，关于铝对植物生长发育的影响、铝毒害机制和植物的耐铝机制还没有一致意见。 本实验对两个不同耐铝品种BX10(耐性品种)和BL2(敏感品种)在铝毒胁迫下的一些生理生化指标进行了测定，以分析它们对铝毒反应的差异。并结合蛋白质组学研究铝毒胁迫下蛋白质的差异表达，以寻找与耐铝毒相关蛋白，为遗传改良耐铝大豆品种及进一步了解其分子机制奠定必要的基础。 通过测定铝毒害的两个重要指标—根的伸长和胼胝质的量，并结合苏木精染色和希夫试剂染色法评定两个大豆品种的耐铝性差异。根伸长的测定结果表明：铝毒处理6h，BX10根长的伸长率为78％，而BL2的根长伸长率为63％；铝毒处理48h，BX10根长的伸长率为36％，而BL2的根长伸长率为15％。品种BL2根尖的胼胝质含量在铝毒处理12h达到最大值，为483μg/gFW，而BX10根尖的胼胝质量在铝毒处理24h达到最大值，为406μg/gFW。统计分析表明在12h、48h和72h BL2根尖的胼胝质的量均显著地高于BX10。苏木精染色观察显示在铝毒处理12h品种BL2根尖积累铝的量明显多于品种BX10；希夫试剂脂膜氧化染色观察表明在铝毒处理3h BL2根尖的粉色明显深于BX10。以上实验结果表明BX10比BL2有较强的耐铝性。 氧化胁迫危害是铝毒害的另一个重要的症状，有许多报道表明缓解氧化胁迫在一定程度上可以缓解铝毒害。丙二醛的量越多，表明植物受到的伤害越大，测定氧化胁迫相关指标表明品种BL2丙二醛的增加幅度高于BX10，品种BL2的丙二醛含量随着铝毒处理时间一直呈上升趋势，而BX10丙二醛的量在铝毒处理48h后有下降的趋势，除了3h和72h外，其余时间处理后BL2的丙二醛的增加量均显著高于BX10；铝毒胁迫下品种BL2根部的SOD酶活随着处理时间的增加呈线性增加，而BX10根部的SOD酶活的增加相对缓慢，BL2的SOD酶活在铝毒胁迫下增加的量在6h，12h，48h和72h均显著地高于BX10；在铝毒胁迫24h品种BL2和BX10的CAT酶活分别增加了47％和12％，在72h其CAT酶活分别增加了95％和44％，在12h和72h BL2的CAT酶活显著高于BX10；铝毒胁迫下POD的酶活在初期变化不明显，在处理48h和72h BL2的POD的酶活显著高于BX10。铝毒胁迫下CAT和POD的酶活变化在早期变化不明显，尤其是POD。比较铝毒胁迫下两个品种的CAT酶活变化，其变化趋势与SOD的较相似，但其变化相对于SOD滞后一段时间。实验结果表明BL2受到的氧化胁迫的程度大于BX10。从实验结果推测抗氧化酶系SOD和POD，CAT酶活可能协调平衡变化，减少活性氧对植物的伤害。在两个大豆品种中，这些酶活变化至少部分参与耐铝诱导的氧化胁迫反应。本研究中应用差异蛋白质组学研究铝毒胁迫下大豆BX10的蛋白质表达。将生长一周的大豆幼苗BX10置于50 μM AlCl3和0μM AlCl3处理，分别于不同时间(24h、48h和72 h)取大豆幼苗的根系，通过双向电泳技术分离研究铝毒胁迫下蛋白质的时间表达情况。在IPG 4-7凝胶中重复地分离检测到1200多个蛋白质点，分离得到的蛋白质图谱经过Image Master 2D Elite 5.0软件包进行蛋白点的检测、配比和差异分析等。39个差异较明显的蛋白质点经基质辅助激光解吸附/电离飞行时间法(matrixassisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS)，其中包括13个新诱导蛋白质点，21个上调蛋白质点和5个下调蛋白质点。质谱鉴定结果：5个未知功能的蛋白质和8个蛋白质点在目前的蛋白质数据库中没有与之匹配外，根据数据库中与已鉴定的蛋白质序列的相似性推定出另外的25个蛋白质点的功能。结果显示铝毒胁迫下大豆BX10根部的大部分蛋白质为参与防御胁迫、信号转导、物质转运、分子伴侣活性、基因调节和碳、氮和能量代谢。蛋白点10，18和26分别被鉴定为大豆PR10-like protein，NAD(P)H，dependent 6'—deoxychalcone—synthetase；reductase和2，4-D，inducible glutathione—S—transferase，分析显示与植物耐受铝毒胁迫相关的点可作为今后大豆耐铝毒胁迫研究的目标蛋白。 为了研究蛋白点在基因水平的表达，我们根据铝毒胁迫下大豆的差异蛋白质组学鉴定蛋白质的基因进行引物设计，RT—PCR方法研究基因的不同时间表达。共设计了五个蛋白(GAPDH，LMW heat shock protein，PR10-like protein，2，4-D，inducible glutathione—S—transferase，GTP binding，ATP—binding cassette transporter)相应基因的引物，研究基因表达是否与蛋白质的表达相符。LMW heat shock protein、PR10-likeprotein和ATP—binding cassette transporter的基因大体上随着铝毒处理时间呈增强趋势。2，4-D，inducible glutathione—S—transferase的基因表达在铝毒处理6h达到最大值，而后随着处理时间的增加表达量减弱，这个结果与铝毒胁迫下，拟南芥的2，4-D，inducible glutathione—S—transferase RNA表达模式非常相似。GTP binding protein在铝毒处理6h没有变化，但在处理12h和24h时，RNA的表达量迅速、快速的降低，在处理48h和72h时其表达量又回复到正常的表达水平。总体而言，基因的表达和蛋白的表达模式基本一致或相近。 收起