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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的:先天性肛门直肠畸形(Anorectal malformation,ARM)是一种新生儿肛门直肠发育障碍导致的先天性畸形,其发病率约1/1500-5000,好发于男孩。其中,尿道直肠中隔向泄殖腔膜的发育停滞被认为是主要的致病原因。近年来,先天性肛门直肠畸形的病因学研... 展开 目的:先天性肛门直肠畸形(Anorectal malformation,ARM)是一种新生儿肛门直肠发育障碍导致的先天性畸形,其发病率约1/1500-5000,好发于男孩。其中,尿道直肠中隔向泄殖腔膜的发育停滞被认为是主要的致病原因。近年来,先天性肛门直肠畸形的病因学研究取得了较大的进展,但是由于该疾病的发病机制涉及到一系列环境和遗传因素,且涉及的相关基因及信号通路纷繁复杂,因而无法在单一层面阐述其发病机制。既往学者主要在基因及相关信号通路层面阐释ARM的发病过程,已知的基因包括Shh基因、Gli基因、Bmp4基因、Wnt5a基因、Wnt3a基因、Fgf基因、Fgf10基因、Hox基因及Cdx1基因等。随着后基因组时代的到来,蛋白质组学在探索生命的活动中发挥着越来越关键的作用,蛋白质组学不仅关注转录水平的调控,而且更侧重于翻译水平及翻译后水平的调控。蛋白质组学在研究蛋白质翻译后修饰、亚细胞定位、迁移以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用方面发挥着独特的作用。由于氨基酸残基的种类远远大于核苷酸残基,并且存在复杂的磷酸化、糖基化等翻译后修饰等问题,研究蛋白质必须依靠高通量、高灵敏度的技术平台。最近的研究表明,蛋白质不仅是基因表达的产物,同时还介导细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等功能。目前国内外关于蛋白质水平ARM相关的病因学研究较少见,本文拟从蛋白质水平对先天性肛门直肠畸形的发病机制做一初步探索。 方法:搜集在苏州大学附属儿童医院治疗的各类肛门直肠畸形新生儿的血清18例,作为病例组,性别、年龄及体重匹配(P>0.05)的非消化道畸形、非感染性疾病未开奶患儿血清18例作为对照组。通过iTRAQ技术对15例样本中的蛋白质进行定量分析、功能注释和富集分析,并筛选出相关差异表达蛋白。根据Foldchange值差异4倍以上、P值≤0.05的标准筛选出含缬沙蛋白(Valosin-containing protein,VCP)、原钙粘蛋白24(Protocadherin 24,PCDH24)和纤维蛋白1(Fibulin-1),进行人群样本(3例实验组、3例对照组)WesternBlot验证。根据验证结果再次筛选出VCP、PCDH24进行细胞实验,经RT-PCR检测,筛选效率最佳干扰位点,利用si-RNA分别沉默PCDH24和VCP后,观察人正常结肠上皮细胞(Human colon epithelial cells,Hcope/HCoEpiC)细胞系增殖和凋亡数目的变化。 结果: 通过蛋白芯片筛选出与ARM相关的差异表达蛋白共计701种。在差异倍数≥1.5或者≤0.67,P-value≤0.05情况下,上调蛋白为112种,下调蛋白为77种;差异倍数≥3或者≤0.33情况下,上调蛋白为44种,下调蛋白29种;差异倍数≥4或者≤0.25情况下,上调蛋白为1种,下调蛋白2种。 在功能注释方面:基因本体(Gene Ontology,GO)注释中,主要涉及分子功能(粘附功能、催化功能、酶调节活性、分子传感活性)、细胞组件(胞外组分、胞内细胞器)以及生物学途径(细胞进程、生物调节、代谢调节)等;直系同源簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins,COG)注释中,蛋白数目最多的前五项分别涉及a、翻译后修饰、蛋白质更新以及分子伴侣;b、一般功能预测;c、信号转导;d、细胞骨架;e、翻译、核糖体结构和生物合成;代谢通路注释(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)中,上调蛋白最多的共有12种,主要参与吞噬体通路;下调蛋白最多的共有21种,参与补体和凝血级联通路。 在差异蛋白富集分析中:基因本体(GO)富集分析主要涉及细胞组分(部分胞外区域、胞外区域、囊泡、膜结合囊泡和膜攻击复合体)、分子功能(丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、模式结合、多糖结合、双链核糖核酸结合和胶原结合)以及生物学进程(对外部刺激的反应、趋化性调节、对损伤的反应、炎症反应和白细胞趋化性的调节)。通路富集中:补体凝血级联反应通路中上调和下调显著差异蛋白的数目均为最多,对应分别是7个和21个,在亨廷顿氏病通路,只有4个上调蛋白具有显著性差异。 在人群样本WesternBlot验证中,VCP在ARM组血清中的灰度相对表达值为0.74±0.07,对照组为0.48±0.05,提示VCP在ARMs患儿血清中达表达水平明显高于对照组,P值<0.05,具有显著性差异;PCDH24在ARM组血清中的灰度相对表达值为0.41±0.08,低于对照组中的0.78±0.09,显示PCDH24在ARMs患儿血清中达表达水平低于对照组,P值<0.05,具有显著差异;验证结果与蛋白芯片的结果一致。 体外细胞实验,增殖实验:通过si-RNA沉默PCDH24后,第48小时的Hcope细胞系相对细胞数分别为:空白组:2.634±0.054、对照组:2.522±0.096、病例组2.157±0.062,病例、对照组间的P值<0.05,具有统计学意义;通过si-RNA沉默VCP后,第48小时的Hcope细胞系相对细胞数分别为:空白组:2.607±0.094、对照组:2.464±0.049、病例组:2.098±0.037,病例、对照组间的P值<0.05,具有显著性差异。凋亡实验:通过si-RNA分别沉默PCDH24和VCP后,凋亡细胞数目均增加。 结论:蛋白芯片技术可以有效地筛选出肛门直肠畸形致病相关的蛋白,大量蛋白参与ARM的发病过程;初步筛选出的VCP在肛门直肠畸形患儿血清中呈高表达,PCDH24在肛门直肠畸形患儿血清中呈低表达,与蛋白芯片的表达趋势一致,提示本实验具有良好的可信度;VCP和PCDH24在Hcope细胞中均具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能,提示VCP和PCDH24可能参与人类先天性肛门直肠畸形的发生过程。 收起
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