摘要: 背景及目的：脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells，ASCs)是来源于脂肪组织的一类具有再生能力的细胞，与成熟脂肪组织或骨髓干细胞相比，具有易获得、增殖率高、易分化等优点。因此，ASCs细胞治疗或ASCs辅助组织重建受到越来越多研究者的关注。目... 展开 背景及目的：脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells，ASCs)是来源于脂肪组织的一类具有再生能力的细胞，与成熟脂肪组织或骨髓干细胞相比，具有易获得、增殖率高、易分化等优点。因此，ASCs细胞治疗或ASCs辅助组织重建受到越来越多研究者的关注。目前常见的造成软组织缺损原因包括复杂创伤、肿瘤切除及先天性缺陷，该类疾病对患者心理健康、外貌、生活质量的负面影响较大。稳定、高效、低免疫原性的移植物是治疗巨大体积软组织缺损的关键，但目前尚缺乏能够完全满足临床需要的移植材料，这使得巨大体积软组织缺损移植填充手术难以达到稳定的疗效。ASCs辅助脂肪移植技术(Cell-assisted Lipotransfer，CAL)是巨大体积软组织缺损有效的治疗方式之一，相较于较单纯脂肪移植该疗法可降低脂肪移植物的吸收率，减少并发症的发生。然而，各CAL应用研究之间的脂肪移植物吸收率差异较大，可能与ASCs存活率、细胞状态各异有关。优化ASCs的增殖、分化、旁分泌功能能够有效提高其细胞在体内的存活率、状态和功能，对提高CAL的远期疗效具有重要意义。人参皂苷Rg1(Ginsenoside-Rg1，G-Rg1)是从人参中分离得到的一种天然活性甾体皂苷，被证实可促进ASCs或其他成体干细胞的增殖和多向分化，在软组织重建治疗具有一定的潜在应用价值，但其对ASCs增殖、成脂诱导分化的影响尚不明确。本研究拟探讨G-Rg1在体内、外环境对ASCs增殖、成脂分化功能的影响，同时探索ASCs成脂分化功能在软组织重建中的实际作用及意义，为ASCs在再生医学的临床应用提供理论及实验基础。 材料和方法：1.人脂肪干细胞(Human Adipose-Derived Stem Cells ，hASCs)的分离培养、鉴定。从6名接受了吸脂手术女性患者中获得冗余脂肪组织，通过胶原酶消化方法分离P0hASCs。经过三次传代后，评估P3hASCs的成脂、成骨和成软骨分化潜能。应用细胞流式检测技术鉴定hASCs特异性细胞表面标志物，CD34、CD45、CD54、CD73、CD90、CD105的表达情况。2.体外实验探索G-Rg1对hASCs增殖、成脂分化、旁分泌功能的影响。(1)将hASCs分别以下列五组培养基条件培养，Control组：仅含基本培养基(basal medium，BM)，0.5μMG-Rg1组：0.5μMG-Rg1的BM培养，1.0μMG-Rg1组：1.0μMG-Rg1的BM培养，2.5μMG-Rg1组：2.5μMG-Rg1的BM培养，5.0μMG-Rg1组：0.5μMG-Rg1的BM培养，各组细胞在相应条件下培养10-14天，通过CCK-8试验检测体外G-Rg1对hASCs增殖作用的影响；ELISA检测G-Rg1对hASCs旁分泌功能的影响。(2)将hASCs分别以下列五组培养基条件培养，Control组：仅成脂诱导培养基(Adipogenic induction medium ， AIM)，0.5μMG-Rg1组：0.5μMG-Rg1的AIM培养，1.0μMG-Rg1组：1.0μMG-Rg1的AIM培养，2.5μMG-Rg1组：2.5μMG-Rg1的AIM培养，5.0μMG-Rg1组：5.0μMG-Rg1的AIM培养，各组细胞在相应条件下培养14天后通过油红O染色实验、细胞密度、脂质浓度检测证明G-Rg1对hASCs成脂肪分化能力的影响。(3)将hASCs分为G-Rg1刺激组和对照组。hASCs分别在含有1μMG-Rg1的成脂诱导培养基或无G-Rg1的成脂诱导培养基培养14天后，qPCR、WB试验检测PPARγ2、C/EBPα和ADD1的表达水平。3.体内实验探索G-Rg1对hASCs成脂分化功能的影响。(1)腺病毒感染即绿色荧光标记(GFP-labeled)。根据感染复数(MOI)分为MOI=50、MOI=100、MOI=2003组。将腺病毒(Ad-GFP)转染至hASCs，观察72h，根据荧光亮度选择合适的MOI值，并以此MOI值构建GFP-hASCs进行下一步实验。(2)设立为G-Rg1预处理组和对照组。G-Rg1预处理组：将GFP-hASCs在含有1μMG-Rg1的AIM中培养预处理一周，然后制成1.0ml细胞悬液(2×107/mlhASCs)浸润于0.5×0.5×0.5cm3Cell-loaded胶原支架；对照组：将GFP-hASCs置于AIM中培养一周后植入胶原支架中，植入的细胞密度、数量和支架体积同G-Rg1预处理组。将两组材料分别植入20只裸鼠背部左右侧。12周后处死动物并解剖移植部位的再生组织，测量湿重，通过油红O染色、qPCR、WB等试验，证明体内G-Rg1对hASCs脂肪分化能力的影响。 结果：1.在初始分离和扩增(P1)后可观察到同质的hASCs，培养7-14天达到80-90%的融合。细胞以纺锤形形态单层生长，并表现出较强的增殖能力。通过油红O、茜素红、法阿尔新蓝阳性染色证实hASCs可向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞分化。细胞流式检测结果显示hASCs高表达CD73、CD90和CD105，而CD34和CD45呈现为低表达。2.(1)G-Rg1能够显著促进hASCs增殖并呈浓度依赖性，在一定范围内(0.5-5.0μM)的G-Rg1的刺激浓度越高hASCs增殖能力越强(P<0.05)。(2)在受到G-Rg1刺激第7、14天后，hASCs分泌的VEGF、FGF-2、HGF、IGF-1、GM-CSF、MCP-1、TGF-β1和IL-8浓度均分别高于对照组(P均<0.05)，而IL-6的浓度则显著低于对照组低(P均<0.05)。(3)经G-Rg1刺激的hASCs成脂诱导后与单纯AIM培养的细胞相比胞浆内可观察到较大油红O染色阳性脂滴，不同浓度G-Rg1组的脂肪细胞数量和脂质浓度均高于对照组(P<0.05)，且呈现正向剂量依赖效应，G-Rg1浓度越高，脂肪细胞数量和脂质浓度随之增加。qPCR和WB检测表明G-Rg1刺激组中的PPARγ2、C/EBPα和ADD1表达水平较对照组显著升高(P<0.001)，进一步证明了G-Rg1的促成脂分化能力。3.hASCs经腺病毒感染72h后，MOI=50、MOI=100、MOI=200组均有可见荧光，其中MOI=200组荧光最强，感染效率最好，遂以MOI=200构建GFP-hASCs。将有/无G-Rg1预处理的GFP-hASCs+胶原支架移植至20裸鼠背部左右侧，所有动物均在接受移植术后12周可见移植部位有新生组织形成。G-Rg1预处理组中新生脂肪组织的体积较对照组增大，湿重较对照组显著增加(P<0.001)；油红O染色和H&E染色结果显示，G-Rg1预处理组较对照组有更多的成熟脂肪细胞和脂滴、脂滴较大；免疫荧光检测显示G-Rg1预处理组新生组织中的荧光细胞数多于对照组；细胞密度、脂质浓度检测结果提示G-Rg1预处理组分化的脂肪细胞数量和脂质浓度较对照组明显增多(P<0.001)；qPCR试验表明，G-Rg1预处理组中PPARγ2和ADD1表达水平较对照组明显升高(P<0.001)。 结论：G-Rg1可以优化hASCs增殖、成脂分化和旁分泌功能；在体内环境下hASCs可以转化脂肪细胞，G-Rg1可以促进hASCs在体内存活和成脂肪分化，进而提高hASCs辅助移植的再生组织的存活率。 收起