摘要: 选题依据：酸枣仁和理枣仁同为鼠李科枣属植物的干燥成熟种子，具宁心安神、敛汗之功效。酸枣仁是中医临床改善睡眠的首选中药，而理枣仁多作为云南民间习用药材。近年来，随着酸枣仁药用需求不断增加，野生资源萎缩，市场上频频出现酸枣仁和理枣仁混... 展开 选题依据：酸枣仁和理枣仁同为鼠李科枣属植物的干燥成熟种子，具宁心安神、敛汗之功效。酸枣仁是中医临床改善睡眠的首选中药，而理枣仁多作为云南民间习用药材。近年来，随着酸枣仁药用需求不断增加，野生资源萎缩，市场上频频出现酸枣仁和理枣仁混用的现象，但由于酸枣仁和理枣仁的物质基础及化学差异尚不明确，两者混用无法保障中药临床用药安全。 中药是中华文化的精髓，已有几千年的历史。中药物质基础复杂，包含氨基酸、糖、脂肪酸等初级代谢物以及黄酮、皂苷、生物碱等次级代谢物。因此，寻找和建立适合中药整体性特点及复杂物质体系的中药分析方法尤为重要。近年来，核磁共振技术、气质联用技术、液质联用技术等分析技术蓬勃发展，但各种仪器适合分析的物质不同，单凭一种技术无法满足中药复杂的物质分析，故创新性的开发和建立整合多种平台技术，系统表征中药化学成分，可以推动中药物质基础研究发展。目前，质谱技术可以与多种色谱技术联用，高分辨质谱技术可以串联多种质谱仪，具有高灵敏度、高分辨率、信息量丰富的特点，受到越来越多中药研究学者的青睐，并应用于各种中药分析。 植物代谢组学是代谢组学的一个重要分支。核磁共振技术、气质联用技术和液质联用技术都是植物代谢组学中常用的研究测试工具，具有检测时间短、重复性好、可以批量分析等优势。代谢组学技术将获得高通量的数据，而多元统计分析可以从庞大的数据中提取有用信息，去除干扰信息，反映样本分组的整体差异性。 综上，采用高分辨质谱技术建立快速识别酸枣仁化学成分的方法，应用多种分析技术平台，基于非靶向植物代谢组学技术，全面分析酸枣仁和理枣仁化学轮廓并进行对比研究，找出两者差异代谢物，并对其代表性成分进行靶向定量分析，为酸枣仁和理枣仁药效物质基础研究提供依据。 目的：建立快速、高效、准确的酸枣仁化学成分表征方法；应用建立的成分表征方法，对酸枣仁和理枣仁中成分进行快速鉴定，通过非靶向代谢组学技术比较酸枣仁和理枣仁中初级和次级代谢物；建立LC-MS/MS同时测定9种成分的靶向定量方法，并应用于酸枣仁和理枣仁的质量研究中。 方法：1.采用UHPLC-Q-OrbitrapMS分析技术，FullMS/ddms2数据采集模式，得到酸枣仁的质谱数据。建立酸枣仁化学成分的本地数据库、构建不同类型化合物的理论分子网络，将黄酮类、皂苷类和生物碱类在不同碰撞能量下获得的特征碎片离子，导入CompoundDiscoverer软件CompoundClassScoring模块进行化合物桥接，并与理论分子网络进行匹配，结合化合物二级质谱图实现对酸枣仁中化合物结构的快速识别。2.基于1HNMR、GC-MS及UHPLC-Q-OrbitrapMS技术，结合参考文献和HMDB数据、NIST数据库及酸枣仁化学成分快速识别策略对酸枣仁和理枣仁中氨基酸和糖类、脂肪酸以及次级代谢物进行鉴定。根据主成分分析、正交偏最小二乘判别分析和s-plot分析等化学计量学手段对16批酸枣仁和13批理枣仁进行分析，结合VIP>1和p<0.05筛选出酸枣仁和理枣仁的差异代谢物。运用差异代谢物相对峰面积进行相对含量分析。3.采用UPLC-MS/MS同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法，分别对标准曲线线性关系、仪器精密度、样品稳定性、重复性、加样回收率进行方法学考察。运用建立的方法对29批酸枣仁和理枣仁样品进行含量测定，并将结果进行主成分分析和偏最小二乘判别分析。 结果： 1.通过UHPLC-Q-OrbitrapMS分析技术，构建了酸枣仁中化学成分快速识别的分析策略。首先建立了酸枣仁本地数据库，共114个化合物，包含黄酮50个，皂苷36个，生物碱类成分28个。其次基于化合物的结构特征，建立酸枣仁中化学成分的理论分子网络，分别预测144个黄酮、240个生物碱和32个皂苷。靶向分析各类型化合物的裂解规律，分别确定黄酮、生物碱、皂苷各类成分的特征离子。通过与CD软件进行桥接，共匹配到169个化学成分，其中共90个化合物被初步鉴定，分别为64个黄酮类成分、21个生物碱类成分以及5个皂苷类成分。 2.采用1HNMR技术，参考文献和数据库，共指认酸枣仁和理枣仁中30个初级代谢物，结合VIP>1和p<0.05筛选出亮氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，蛋氨酸，胆碱，柠檬酸，乙酸，蔗糖和棉子糖12个初级差异代谢物。根据聚类热图进行相对含量分析发现，酸枣仁中亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、蛋氨酸、胆碱、柠檬酸和乙酸含量较高，而理枣仁中蔗糖和棉籽糖含量较高；通过GC-MS代谢组学技术，结合NIST数据库，共指认脂肪酸类成分28个，结合多元统计分析，VIP>1和p<0.05筛选出7个脂肪酸类初级差异代谢物分别为硬脂酸、棕榈酸、花生酸、油酸、山嵛酸、亚油酸和维生素E。其中单不饱和脂肪酸如硬脂酸、棕榈酸、花生酸、油酸和二十二烷酸在理枣仁中的含量明显高于酸枣仁，而多不饱和脂肪酸如亚油酸和维生素E在酸枣仁中的含量更高；基于UHPLC-Q-OrbitrapMS技术的次级代谢物分析，采用建立的次级代谢物快速识别策略，在正负离子模式下从酸枣仁中鉴定90个成分，理枣仁中69个成分，综合VIP>1和p<0.05筛选出29个差异代谢物，包括4种皂苷，19种类黄酮和6种生物碱。其中9种芫花素黄酮碳糖在理枣仁中含量较高，环肽生物碱在理枣仁中含量较高。 3.建立了同时测定酸枣仁和理枣仁中乌药碱、木兰花碱、当药黄素、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素、维采宁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的9个成分的UPLC-MS/MS含量测定方法，方法学考察试验证明该方法合理可行，并对29批酸枣仁和理枣仁进行了含量测定。结果显示，酸枣仁中乌药碱、木兰花碱、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量均较理枣仁中含量高，而酸枣仁皂苷A在理枣仁中无法检测。而酸枣仁中维采宁、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素的含量较理枣仁中含量低，与非靶向研究结果一致。多元统计分析PCA和PLS-DA分析结果显示，该9个成分可以很好的将酸枣仁和理枣仁明显区分开，以实现对酸枣仁样品整体质量的控制。 结论：通过以上研究，本论文建立了基于UHPLC-HRMS技术快速识别酸枣仁化学成分的分析策略，应用该策略共鉴定酸枣仁中90个成分。采用1HNMR、GC-MS和LC-MS非靶向代谢组学技术对酸枣仁和理枣仁中初级和次级代谢物进行全面表征，共鉴定酸枣仁中90个次级代谢物，30氨基酸等初级代谢物已及28个脂肪酸类成分，理枣仁中69个次级代谢物，30氨基酸等初级代谢物已经26个脂肪酸类成分，结果表明，两者的化学成分类型及其相似；在此基础上结合多元统计分析，共找到两者12个氨基酸等初级差异代谢物，7个脂肪酸类差异代谢物以及29个次级差异代谢物，结果表明，两者化学成分在含量上呈现较大的化学差异。建立了UPLC-MS/MS同时测定酸枣仁和理枣仁中9种化学成分的方法，为构建科学合理的中药酸枣仁质量标准提供了科学依据。 收起