摘要: 研究背景： 高原低张性缺氧（低氧）对男性生殖功能有显著负面影响，其中，精子生成减少是高原男性生殖功能低下的中心环节。精子生成减少的形成是一个复杂的病理生理过程，体内研究表明，在生精细胞中，精母细胞对低氧最为敏感，但是低氧引起体内... 展开 研究背景： 高原低张性缺氧（低氧）对男性生殖功能有显著负面影响，其中，精子生成减少是高原男性生殖功能低下的中心环节。精子生成减少的形成是一个复杂的病理生理过程，体内研究表明，在生精细胞中，精母细胞对低氧最为敏感，但是低氧引起体内精母细胞凋亡的机制还不明确。 缺氧引起细胞凋亡有两条重要途径：死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径，这两条凋亡途径在肿瘤中被广泛研究，然而这两条凋亡途径是否参与低氧引起的精母细胞凋亡还不清楚。在体内缺血性缺氧所引起的精子生成减少的疾病模型中，HIF-1α与精索静脉曲张、睾丸扭转、寡精症发生发展密切相关，但是HIF-1α是否参与高原低氧所引起的精母细胞凋亡，以及HIF-1α与两条凋亡途径间的调控机制更无从知晓。 巨自噬（简称自噬）开始形成于以Beclin-1连接的自噬起始复合物，复合物相互连接形成双层膜结构，双层膜进一步延长形成闭合环装的自噬小体，自噬小体包裹细胞内破坏的细胞器和损伤的蛋白并与溶酶体融合，最终细胞得以存活。 自噬与凋亡是两个紧密联系的病理生理学过程，自噬先于凋亡出现，当外界刺激出现时，自噬出现并抑制凋亡；当外界刺激超过一定限度时，凋亡反过来抑制自噬并正反馈加强凋亡。阐明低氧下精母细胞自噬与凋亡相互作用的分子机制，对于研究低氧引起的精子生成减少有着重要的现实意义。 本研究旨在查明低氧引起精母细胞凋亡的内在机制，明确低氧对精母细胞自噬的影响，以及探讨自噬和凋亡在精母细胞中相互作用的分子机制。为防治低氧引起的精子生成减少提供新策略和新靶点。 研究方法与内容： 1.建立低氧（1%氧浓度）诱导小鼠精母细胞系GC-2凋亡模型，并使用TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡。 2.缺氧处理GC-2细胞48h后，酶标法检测LDH含量、Caspase-8含量；WesternBlot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas等死亡受体（Death Receptor/DR）凋亡途径相关基因表达，RT-qPCR法检测DR凋亡途径各相关基因mRNA表达。低氧下加入caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK，酶标法检测细胞增殖活性。探讨DR凋亡途径在低氧诱导GC-2细胞凋亡模型中的作用。 3.低氧结束后，酶标法检测Caspase-3/9含量；JC-1探针法检测线粒体跨膜电位；检测p53、Bcl-2、Bax等线粒体凋亡途径相关基因蛋白表达，RT-qPCR法检测线粒体凋亡途径各相关基因mRNA表达。低氧下特异性抑制caspase-9和同时抑制caspase-8和caspase-9后，酶标法检测细胞增殖活性。探索线粒体凋亡途径在低氧诱导GC-2细胞凋亡模型中的作用。 4.低氧条件下转染HIF-1α特异性siRNA，采用流式细胞术检测GC-2凋亡，酶标法检测caspase-3/8/9含量，Western Blot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas、p53、Bcl-2、Bax等凋亡途径相关基因蛋白表达；研究HIF-1α在低氧激活DR凋亡途径和线粒体凋亡途径中的作用。 5.建立低氧抑制小鼠精母细胞系GC-2自噬模型，并使用mCherry-GFP-LC3B法标记自噬小体与自噬性溶酶体并观察自噬流；流式细胞术检测自噬；Western Blot法检测Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-Ⅱ、p62、mTOR、LAMP2、VMA等自噬途径相关基因蛋白表达。 6.低氧下转染Caspase-8特异性siRNA，采用酶标法检测GC-2细胞Caspase-3/8含量；mCherry-GFP-LC3B法观察自噬流；Cyto-ID法和吖啶橙法检测自噬；Western Blot法检测caspase-3/8、cleaved caspase-8、Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-Ⅱ、p62、mTOR、LAMP2、VMA等蛋白表达。 7.低氧下过表达Beclin-1，运用Cyto-ID法检测GC-2细胞自噬；TUNEL法和Annexin V-FITC法检测凋亡；JC-1法检测线粒体跨膜电位；Western Blot法检测DR5、c-FLIP、DcR2、TRAIL、Fas、p53、Bcl-2、Bax蛋白表达。 8.睾丸注射Puro-Beclin1慢病毒，模拟海拔5000米低压低氧暴露30天，建立小鼠精子生成减少模型；HE染色和透射电镜观察生精小管结构变化；TUNEL法检测生精细胞凋亡。 研究结果： 1.与常氧对照组比较，1%氧暴露24h可诱导GC-2细胞凋亡增加，并且凋亡增加呈时间依赖性。 2.低氧处理48h后，GC-2细胞DR5、TRAIL、Fas的mRNA水平和蛋白表达均显著增加，c-FLIP和DcR2的mRNA水平和蛋白表达均显著减少，DcR1的mRNA水平显著下降；LDH和caspase-8含量显著升高；与低氧对照组比较，特异性抑制caspase-8后，细胞增殖活性显著增加。 3.低氧处理后，GC-2细胞Bax和p53的mRNA水平和蛋白表达均显著增加，Bcl-2的mRNA水平和蛋白表达均显著下降；caspase-3/9含量显著增加；线粒体去极化占极化比例显著增加；与低氧对照组比较，特异性抑制caspase-8后，细胞增殖活性显著增加；与常氧对照组比较，同时特异性抑制caspase-8和caspase-9后，细胞增殖活性无显著差异。 4.低氧暴露下转染HIF-1α特异性siRNA后，GC-2细胞凋亡和caspase-3/8/9含量显著下降；DR5、TRAIL、Fas、Bax和p53的蛋白表达显著下降，c-FLIP、DcR2和Bcl-2的蛋白表达显著增加。 5.与常氧对照组GC-2细胞比较，1%氧暴露24h可抑制自噬，并且自噬呈时间依赖性降低；GC-2细胞Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-Ⅱ、LAMP2、VMA蛋白表达显著下降，p62和mTOR的蛋白表达显著增加。 6.低氧暴露48h和60h后，转染GC-2细胞caspase-8特异性siRNA，caspase-3/8含量显著下降；GC-2细胞自噬显著增加；Beclin-1、ATG5、BNIP-3、VPS34、LC3-Ⅱ、LAMP2、VMA蛋白表达显著升高，caspase-8、p62和mTOR的蛋白表达显著降低。 7.1%氧暴露48h和60h后，过表达Beclin-1的GC-2细胞自噬显著升高，细胞凋亡显著下降，线粒体去极化占极化比例显著下降；caspase-3/8、cleaved caspase-8、DR5、TRAIL、Fas、Bax和p53的蛋白表达显著下降，c-FLIP、DcR2和Bcl-2的蛋白表达显著增加。 8.模拟海拔5000米低压低氧暴露小鼠30天后，Puro-Beclin1慢病毒转染后的小鼠睾丸中自噬流显著增加，生精小管病损程度减轻，生精细胞凋亡率显著降低。 研究结论： 1.低氧通过DR凋亡途径和线粒体凋亡途径诱导GC-2细胞凋亡。 2.在低氧诱导的GC-2细胞凋亡中，DR凋亡途径和线粒体途径可能是由HIF-1α调控的。 3.低氧通过促进caspase-8的活化，抑制GC-2细胞自噬，使低氧诱导的GC-2细胞凋亡进一步增强。 4.低氧下过表达Beclin-1可降低线粒体外膜通透和精母细胞凋亡，并且缓解精子生成减少。 5.精母细胞中的Beclin-1和caspase-8基因在精子生成减少的形成中发挥重要作用，有望成为治疗精子生成减少的有效靶点。 收起