摘要: 纳米氧化锌(ZnO NPs)被广泛应用于工业、日用品、生物医学等领域，对人类健康的潜在安全性问题备受关注。研究表明，ZnO NPs可通过呼吸道、消化道等途径进入人体，还可经血循环到达身体其他组织器官，引发相应器官损伤。目前认为，ZnO NPs毒性效应机制... 展开 纳米氧化锌(ZnO NPs)被广泛应用于工业、日用品、生物医学等领域，对人类健康的潜在安全性问题备受关注。研究表明，ZnO NPs可通过呼吸道、消化道等途径进入人体，还可经血循环到达身体其他组织器官，引发相应器官损伤。目前认为，ZnO NPs毒性效应机制主要是由其诱导氧化应激导致的，氧化应激可引发炎症、DNA损伤及细胞凋亡等。氧化应激也可引起靶细胞的应激反应，包括基因表达改变。然而，目前ZnO NPs关键响应基因认识并不全面。 在本研究中，首先评价ZnO NPs对人肺泡上皮细胞A549的毒性效应。表征鉴定结果显示，实验用的ZnO NPs平均粒径为37.32nm，呈立体晶体状，分散性较好且稳定。利用CCK-8检测ZnO NPs作用于A549细胞后的相对细胞活力，结果显示，ZnO NPs对A549细胞显著抑制浓度为7.5μg/mL，并且随着ZnONPs浓度和时间的增加，细胞活力逐渐下降。此外，检测ZnO NPs作用于细胞后总活性氧(ROS)生成情况，发现ROS含量随ZnO NPs浓度增加呈现递增趋势，7.5μg/mL引起ROS含量升高至对照组2倍。利用PI和AnnexinⅤ-FITC染色法检测ZnO NPs处理后细胞凋亡情况。 结果显示，7.5μg/mL的ZnO NPs引起Sub-G1期及AnnexinⅤ阳性细胞数显著增加，说明ZnO NPs处理引起细胞凋亡。 mRNA翻译的调控在基因表达中发挥有重要作用，然而ZnO NPs对翻译的影响目前尚没有研究。于是，首先检测了ZnO NPs作用于A549细胞后核糖体的分布情况，结果显示，ZnO NPs处理后多聚核糖体（翻译效率高）比例显著降低，而单核糖体（翻译效率低）比例显著增加，说明整体翻译水平被抑制。此外，检测ZnO NPs处理后翻译调控蛋白4EBP1、eIF2α的磷酸化修饰水平，发现4EBP1的磷酸化水平逐渐降低，eIF2α的磷酸化水平逐渐升高，进一步说明ZnO NPs抑制细胞mRNA翻译。活性氧清除剂NAC预处理后，ZnO NPs对细胞翻译的抑制效应得以恢复，说明ZnO NPs通过氧化应激抑制细胞整体翻译水平。 随后，利用核糖体展示技术(Ribo-seq)筛选ZnO NPs处理后翻译水平差异表达基因。以两倍变化为标准筛选到翻译水平差异表达基因2667个，其中2597个基因翻译下调，70个基因翻译上调。GO功能性分析发现翻译差异表达基因在生物学过程、细胞成分和分子功能中分别富集于细胞黏附、各种细胞膜成分和钙离子结合等。KEGG通路分析则发现差异表达基因主要富集于溶酶体、细胞外基质-受体相互作用以及各种信号通路如Notch、PI3K-Akt、Wnt等。STRING数据库聚簇分析发现，翻译表达上调基因主要集中在两个功能丰富的簇集上，一个是转录因子簇（包括FOS、FOSB、JUNB、EGR1等），另一个是核糖体蛋白簇（包括RPL22、RPL10、RPS27A等）。 进一步对ZnO NPs处理后核糖体蛋白簇中变化最为显著的RPL22进行验证。 结果显示，ZnO NPs处理A549细胞后RPL22的蛋白水平上调，而mRNA水平没有明显变化，提示ZnO NPs在翻译水平促进RPL22表达。为明确核糖体蛋白RPL22在ZnO NPs诱导A549细胞凋亡中的作用，利用shRNA抑制内源RPL22表达后，检测细胞凋亡情况。 结果表明，与对照组相比，敲降RPL22组Sub-G1期（凋亡细胞）细胞数显著减少，说明RPL22介导ZnO NPs促进的细胞凋亡。 综上所述，本论文发现：1）ZnO NPs引起A549细胞活力降低、ROS升高和细胞凋亡;2）ZnO NPs抑制A549细胞翻译，降低蛋白质合成速率;3）ZnO NPs处理A549细胞1小时可影响约3，000个mRNA的翻译，差异表达基因功能富集于细胞黏附、溶酶体等;4)ZnO NPs影响包括RPL22在内的多个核糖体蛋白的翻译上调;5）核糖体蛋白RPL22介导ZnO NPs诱导的细胞凋亡。本论文首次系统研究ZnO NPs短时间作用对细胞翻译的影响，证明ZnO NPs引起的翻译改变参与其毒性效应。对差异基因功能的进一步深入研究将有助于阐明ZnO NPs毒性效应机制。 收起