摘要: 背景:间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我更新能力的细胞，在一定的诱导条件下它能够分化为脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞类型的多能干细胞，并能分泌多种生长因子诱导血管生成。这使得间充质干细胞在再生医学方面得到了广泛的... 展开 背景:间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我更新能力的细胞，在一定的诱导条件下它能够分化为脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞类型的多能干细胞，并能分泌多种生长因子诱导血管生成。这使得间充质干细胞在再生医学方面得到了广泛的关注。目前，利用干细胞移植技术治疗缺血性疾病是一个快速发展的领域，其安全性和有效性已经被不同的研究证实。MSCs治疗缺血性心肌病其原理是通过移植或动员干细胞进入缺血性的心肌组织，增加梗死区域心肌样细胞数量及毛细血管数量，逆转心脏重构，进而改善心功能。虽然MSCs向心肌细胞分化能力还存有争议，但MSCs向内皮细胞、平滑肌细胞或血管周细胞的分化能力已得到证实。血管生成能力的增强有助于增加血管数量，从而改善心脏功能。MSCs移植可以通过刺激血管生成来促进心肌的修复，是一种有前景的缺血性心脏病治疗的细胞类型。 Hedgehog(Hh)蛋白是一种在胚胎发育过程中具有重要作用的成形素，它们控制着胚胎发育过程中不同的组织和器官的发育模式。VEGF信号通路是调节血管发育和内皮细胞分化的重要信号通路之一，VEGF诱导MSCs向内皮细胞分化的确切调控机制还未明确。Shh与多种血管生成因子相关，能促进VEGF的表达，参与血管的新生，对急性及慢性心肌缺血模型和缺血再灌注损伤模型有明显的治疗作用。Shh可以通过激活血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素促进血管生成，因此Shh可能是血管生成的关键调控分子之一，因此也被认为是增强血管生成较有前景的治疗分子。 第一部分 过表达Shh基因的大鼠BMSCs的构建 目的:从大鼠中分离骨髓间充质干细胞，并利用慢病毒系统构建Shh过表达的MSCs细胞株。 方法:首先从幼龄大鼠中分离骨髓间充质干细胞(BMSCs)，取传至第三代的细胞，流式细胞技术对表面相关标记分子进行检测。然后利用PCR扩增技术成功的克隆出了Shh基因，并利用慢病毒系统将Shh基因在BMSCs细胞中稳定过表达。 结果:检测结果显示，CD90、CD29抗原在细胞表面高表达，MHCⅡ和CD11b/c在细胞表面不表达，表明分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。RT-qPCR检测发现，MSCs中Shh mRNA的表达水平上调，且Shh mRNA表达水平在转染后3天和7天中增加了约3000倍和5000倍。 结论:成功的从大鼠骨髓中分离出间充质干细胞，并成功的构建过表达Shh基因的MSCs细胞株。 第二部分 Shh基因促进BMSCs向内皮细胞分化能力的研究 目的:体外实验验证过表达Shh基因后，对于MSC向内皮细胞分化的影响。 方法:利用RT-qPCR分别检测Shh转染3天和7天后MSCs细胞中，促血管生成分子Ptch1、IGF1、HGF、Ang-1以及VEGF-A的表达水平，并在分别使用管样形成实验、Transwell迁移实验和体内胶栓实验，检测了MSCShh管样形成能力、细胞的迁移能力和向内皮细胞分化的能力。 结果:过表达Shh后，MSCs细胞中促血管生成分子表达水平上调，MSCShh的管样形成能力、迁移能力和向内皮细胞分化的能力显著高于MSCNC对照组。而且转染后7天的MSCShh细胞的成管长度和节点数量以及向内皮细胞分化能力明显高于转染后3天的细胞。 结论:过表达Shh基因后，MSCs中促血管生成生长因子的表达增加，体外迁移能力、成管能力增强以及血管新生的能力增强。 第三部分 过表达Shh基因的BMSCs治疗大鼠心肌梗死的疗效探究 目的:大鼠心梗模型中验证过表达Shh基因后，MSC对心梗的修复效果。 方法:将Shh过表达前后的MSC细胞，移植到大鼠心梗模型中。心超检测心功能的恢复情况，Masson染色观察纤维化心梗后的纤维化面积。 结果:MSCNC以及MSCShh均能够修复心梗后的心功能，且向较于MSCNC组，MSCShh组的修复效果更加明显。 结论:过表达Shh基因后，MSC细胞能更有效地减少梗死区域面积，改善心功能。 第四部分Shh基因促进BMSCs的内皮细胞分化能力的机制探讨 目的:进一步的研究探讨，过表达Shh基因的MSCs细胞向内皮分化的具体机制。 方法:将MSCNC和MSCShh的进行高通量测序，并对测序结果进行初步分析，找出差异表达的基因，筛选靶基因。利用siRNA技术，将靶基因沉默后分别验证MSCNC细胞的成管能力和心梗修复的能力。 结果:结果发现MSCShh中，VEGF-D等与血管生成相关的基因的表达远高于在MSCNC中的表达。特别是在过表达Shh后VEGF-D的表达水平明显上调，提示Shh分子可能通过促进VEGF-D的表达进而促进血管新生。并进一步分别在细胞水平和动物水平上对此进行验证。用siRNA抑制VEGF-D的表达后，MSCShh的成管能力下降，体内实验发现其心梗后的修复效果受到抑制。 结论:Shh基因可以通过Shh/VEGF-D信号轴促进骨髓间充质干细胞的向内皮分化。 收起