摘要: 本研究检测了lncRNA Ftx及其潜在靶基因PPARγ的异常表达，以确定调控肝癌有氧糖酵解的可能的信号通路，并探索新的治疗靶点。研究结果表明，lncRNAFtx在人肝癌组织和细胞系中表达上调，值得注意的是，通过与临床指标及预后的统计学分析，发现lncRNA F... 展开 本研究检测了lncRNA Ftx及其潜在靶基因PPARγ的异常表达，以确定调控肝癌有氧糖酵解的可能的信号通路，并探索新的治疗靶点。研究结果表明，lncRNAFtx在人肝癌组织和细胞系中表达上调，值得注意的是，通过与临床指标及预后的统计学分析，发现lncRNA Ftx与肿瘤侵袭有关的临床病理学特征相关，且是肝癌患者预后不良的独立危险因素。以人肝癌细胞系为研究对象，通过干扰或重建lncRNA Ftx表达，发现lncRNA Ftx下调能抑制肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭，而lncRNA Ftx过表达则导致了相反的结果。此外，lncRNA Ftx还能影响肝癌细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的产生，表明lncRNA Ftx可能参与到了肝癌的有氧糖酵解中。这一假设通过测定糖代谢中关键分子葡萄糖转运蛋白的表达、关键酶的活性及表达得到了验证。而进一步对于机制的探讨发现，lncRNA Ftx与PPARγ在序列上高度匹配，PPARγ在人肝癌组织中的表达与lncRNA Ftx呈正相关，且lncRNA Ftx能促进肝癌细胞中PPARγ的表达并调控其下游效应因子。在干扰lncRNA Ftx的Bel-7402细胞中，PPARγ的活化能部分地挽救由lncRNAFtx下调导致的葡萄糖摄取量减少、乳酸产生减少和糖酵解的减弱;类似地，在过表达lncRNA Ftx的Huh7细胞中，抑制PPARγ能部分地抵消由lncRNA Ftx介导的糖酵解活跃。总之，lncRNAFtx是Warburg效应和肿瘤进展的启动子，其调控作用部分通过PPARγ通路，并且可以作为未来肝癌治疗的有效靶点。 第一部分 LncRNA Ftx在肝癌组织中的表达及其临床意义 目的： 研究lncRNA Ftx在肝癌及癌旁组织中的表达情况，与多种与肿瘤进展或预后相关的临床病理学指标间的相关性，及其对肝癌预后的影响。 方法： 1.选取2012年2月到2013年1月期间于山东大学附属省立医院行手术治疗的73例肝癌病人，收集其癌组织及远端癌旁组织标本，超低温保存以备检测。 2.采用实时逆转录定量聚合酶链反应(Reverse transcription-quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR)的方法，检测人肝癌组织及对应的癌旁组织中lncRNA Ftx的表达水平。 结果： 1.73例肝癌组织和癌旁组织标本中，肝癌组织中的lncRNA Ftx的表达水平显著高于对应的癌旁组织中的表达水平。 2.尽管lncRNA Ftx与肝癌患者的年龄、性别及肿瘤大小未显示出明显的相关性，lncRNA Ftx高表达与肝癌组织的分化程度、转移情况及包膜完整性相关。 结论： LncRNAFtx在肝癌组织中表达上调，并与肿瘤组织的分化程度、转移情况及包膜完整性密切相关，且lncRNA Ftx高表达是肝癌患者预后不良的独立危险因素，提示lncRNA Ftx高表达可能促进肿瘤侵袭和远端转移，从而导致患者的预后不良。 第二部分 LncRNA Ftx对肝癌细胞生物学行为及有氧糖酵解的影响 目的： 研究lncRNA Ftx对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学功能及有氧糖酵解的影响及调控作用。 方法： 1.筛选合适的细胞系:体外培养人正常肝细胞LO2及肝癌细胞系Huh7、SMMC-7721及Bel-7402，并检测lncRNAFtx的基础表达水平。 2.慢病毒(lentivirus，LV)设计与包装:构建短发卡RNA(short hairpin RNA，ShRNA)慢病毒介导的LV-Ftx-RNAi及其空白对照慢病毒;构建过表达慢病毒介导的LV-Ftx及其空白对照慢病毒。 3.慢病毒转染:根据预实验得到的复感染指数(multiplicity of infection，MOI)及转染条件，将ShRNA慢病毒介导的LV-Ftx-RNAi及其空白对照慢病毒转染入肝癌细胞系Bel-7402中，将过表达慢病毒介导的LV-Ftx及其空白对照慢病毒转染入肝癌细胞系Huh7中，并连续培养。 结果： 1.LncRNA Ftx在肝癌细胞系中的表达水平明显高于正常肝细胞，且在Bel-7402中最高，Huh7中最低，因此选取Bel-7402细胞系用于下调lncRNA Ftx，而Huh7细胞系用于过表达lncRNA Ftx。 2.经慢病毒转染及嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察肝癌细胞病毒转染率可达90％以上，细胞生长状态良好。 3.RT-qPCR验证lncRNAFtx慢病毒干扰及过表达效率，结果显示与各自的对照组相比，Bel-7402细胞中lncRNA Ftx下调效率可以达到74.68％，而Huh7细胞中lncRNA Ftx的过表达效率达12倍左右。 4.细胞功能学实验:干扰lncRNA Ftx可以抑制Bel-7402细胞的增殖能力、克隆形成的数量及体积、迁移能力和侵袭能力;而过表达lncRNA Ftx可以增加Huh7细胞的增殖能力、克隆形成的数量和体积、迁移能力和侵袭能力。 5.葡萄糖摄取的测定:干扰lncRNA Ftx能够抑制GLUTs的表达从而降低葡萄糖的摄取;而过表达lncRNA Ftx能促进GLUTs的表达从而增加葡萄糖摄取。 6.糖酵解程度的测定:干扰lncRNA Ftx能降低糖酵解关键酶LDH及糖酵解途径关键酶PFKL的活性，及PFKL的表达水平从而减少乳酸的生成;而过表达lncRNAFtx能增强LDH、PFKL的活性及PFKL的表达水平从而促进乳酸的生成。 7.三羧酸循环的测定:干扰lncRNA Ftx能增强三羧酸循环关键酶类CS、IDH1及OGDH的活性及表达水平，从而促进氧化磷酸化;而过表达lncRNA Ftx能降低CS、IDH1及OGDH的活性及表达水平，从而抑制氧化磷酸化。 结论： LncRNA Ftx能通过调控糖酵解及三羧酸循环途径中关键分子及关键酶的活性及表达，从而促进肝癌细胞的有氧糖酵解，抑制其氧化磷酸化，进而促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭等生物学过程。 第三部分 LncRNA Ftx调控肝癌有氧糖酵解及进展的机制研究 目的： 阐明lncRNA Ftx调控肝癌有氧糖酵解及进展的分子机制。 方法： 1.生物信息学分析进行靶基因预测:应用BLASTn程序对lncRNA Ftx进行生物信息学分析，预测lncRNA Ftx可能的靶基因。 2.利用RT-qPCR检测肝癌组织中PPARγ的mRNA表达水平，并用Pearson相关性分析检测其与lncRNA Ftx表达水平之间的相关性。 3.应用RT-qPCR及Western blot检测慢病毒稳定转染的肝癌细胞中PPARγ及其下游效应因子（如TNFα、瘦素及PDK1）的mRNA及蛋白表达水平。 4.在lncRNA Ftx低/高表达的肝癌细胞中分别应用PPARγ激动剂吡格列酮及抑制剂GW9662，检测葡萄糖摄取、乳酸生成量及乳酸脱氢酶活性、糖代谢途径中关键酶、关键分子及PPARγ下游效应因子的mRNA表达水平。 结果： 1.根据生物信息学分析，Ftx的940-1058 nt（长约118nt）与PPARγ在序列上高度同源，表明lncRNA Ftx可能与PPARγ相互作用，并从转录及转录后水平对PPARγ进行调控。 2.肝癌组织中lncRNA Ftx的表达水平与PPARγ的mRNA表达水平呈正相关。 3.干扰lncRNA Ftx能降低Bei-7402细胞中PPARγ的mRNA及蛋白质表达水平，并升高其下游效应因子的表达;而过表达lncRNA Ftx能促进Huh7细胞中PPARγ的mRNA及蛋白质表达水平，并降低其下游效应因子的表达。 4.在干扰lncRNA Ftx的Bel-7402细胞中，应用PPARγ的激动剂吡格列酮能部分的挽救由干扰lncRNA Ftx介导的有氧糖酵解的降低，并能降低其下游效应因子的表达;而在过表达lncRNA Ftx的Huh7细胞中，抑制PPARγ能部分消除由lncRNA Ftx过表达介导的有氧糖酵解的活跃，且升高下游效应因子的表达。 结论： LncRNA Ftx至少是部分通过PPARγ通路调控肝癌的有氧糖酵解及进展，是潜在的肝癌的治疗靶点。 收起