摘要: 目的: 我国是世界上胃癌发病率最高的国家之一，其死亡率位居所有肿瘤死亡率的前三位。胃癌患者的预后与诊断时肿瘤分期密切相关，但是绝大部分患者诊断时已经处于晚期，失去了根治性手术的机会。对于这部分患者，系统化疗是唯一有效的治疗选择，但... 展开 目的: 我国是世界上胃癌发病率最高的国家之一，其死亡率位居所有肿瘤死亡率的前三位。胃癌患者的预后与诊断时肿瘤分期密切相关，但是绝大部分患者诊断时已经处于晚期，失去了根治性手术的机会。对于这部分患者，系统化疗是唯一有效的治疗选择，但结果令人沮丧，患者中位生存时间仅在1年左右。胃癌的发生发展是一个极为复杂的过程，其中肿瘤细胞增殖和迁移能力的改变在肿瘤浸润与转移上具有非常重要的意义，因此探讨胃癌侵袭转移相关基因及其产物在胃癌侵袭转移过程中的作用，有助于加深我们对胃癌侵袭转移调控机制的理解和认识，也为胃癌侵袭转移的早期诊断和治疗靶向的发现提供理论依据。 钙黏素（Cadherin，钙依赖黏附素）是一群功能相关的跨膜糖蛋白，具有调节钙依赖的细胞黏附的功能。钙黏素由于免疫特异性和组织分布的不同分为若干亚类，如E-、P-和N-Cadherin。研究表明，钙黏素蛋白家族在动物整个身体发育和组织构成上具有非常重要的意义，并与肿瘤发生密切相关。CDH17即肝肠钙黏连蛋白（Liver-Intestine Cadherin或Li-cadherin、HPT-1），是新近发现的钙黏素家族中的一员，其结构与以E-cadherin为代表的经典钙黏素之间有着非常大的差异。越来越多的研究表明，CDH17与肿瘤分化程度和侵袭转移密切相关。但CDH17在结肠癌中的作用与其在肝癌或胃癌中的表现存在显著差异，甚至完全相反，提示CDH17功能复杂，其在不同肿瘤中的作用并非完全一致。为了弄清CDH17在胃癌发生发展中的作用及其可能机制，本课题在采用量子点免疫组织化学染色检测(quantum-dots based immunochemistry)胃腺癌组织及癌旁正常组织中CDH17表达的基础上，进一步利用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interfrence，RNAi)技术构建能稳定沉默CDH17表达的胃腺癌细胞系，通过体内外实验检测CDH17沉默后，胃腺癌细胞系增殖、凋亡、侵袭、转移能力的变化，并利用蛋白组学技术比较CDH17沉默前后，胃腺癌细胞系中蛋白表达的变化，初步筛选出与CDH17表达密切相关的蛋白质。上述研究旨在进一步揭示CDH17在胃癌发生发展中的作用，并为CDH17作用机制的研究提供新的线索和思路。 方法: 1.量子点免疫组织化学染色法(quantum-dots based immunochemistry)检测CDH17在胃腺癌组织及癌旁正常组织中的表达，利用CRI多光谱显微成像系统对指标进行定量，分析CDH17的表达与胃腺癌临床病理因素之间的关系。 2.设计合成4个与CDH17基因（GenBank accession number NM_004063）完全互补的miRNA序列pcDNA-CDH17-miR-SR_1、-SR_2、-SR_3、-SR_4和-SR_neg（阴性对照），构建pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR表达载体，筛选出沉默效率最高的表达载体进行慢病毒包装并转染人胃腺癌细胞系BGC823，构建能稳定沉默CDH17表达的胃癌细胞系。 3.运用CCK-8法、克隆形成实验观察抑制CDH17表达后胃腺癌细胞系BGC823增殖能力的变化;通过PI染色流式细胞仪分析及免疫印迹法(western blot)检测细胞周期及周期蛋白cyclin-D1、-E的改变;通过AnnexinⅤ-APC/PI流式双染，Hoechst33258荧光染色法检测CDH17沉默前后细胞凋亡变化;运用划痕实验检测细胞体外迁移能力的改变;通过裸鼠原位移植瘤实验，检测细胞体内增殖、侵袭、转移能力的变化;通过瘤内注射实验，检测CDH17-RNAi-Lentivirus抑制肿瘤生长的作用，免疫组织化学染色检测移植瘤组织中CDH17的表达，末端转移酶标记实验（TUNEL法）检测移植瘤细胞凋亡情况。 4.运用双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）及质谱分析技术(mass spectroscopy technology，MS)，检测CDH17沉默前后，胃腺癌细胞系BGC823中蛋白质表达的变化，初步筛选出与CDH17表达密切相关的蛋白质。 结果: 1.CDH17主要在胃黏膜上皮肿瘤细胞胞膜及少部分胞浆表达。31例胃腺癌组织中CDH17蛋白平均含量为5.3768±4.0292，而10例癌旁正常组织中CDH17蛋白总含量仅为0.0874±0.0933，两组差异显著(P=0.000)。同时CDH17在高、中、低分化的胃腺癌组织中表达逐渐降低，分别为11.470±6.104、5.799±2.791和3.414±2.407(P=0.000)。在伴有淋巴结转移的胃腺癌组织中CDH17的表达水平明显高于不伴有淋巴结转移者（6.167±4.188vs2.669±1.699，P=0.041）。 2.针对CDH17基因构建的4个miRNA干扰载体和1个阴性对照载体，转化至感受态细胞DH5α后，经酶切和测序表明插入的片段序列与设计合成的CDH17miRNA编码序列完全一致，证明miRNA干扰载体全部构建成功。瞬时转染干扰质粒及阴性对照质粒，24h后荧光显微镜下观察各组细胞中均见绿色荧光蛋白(GFP)表达。根据real-time RT-PCR和western blot检测结果筛选出瞬时共转染BGC823细胞48h后抑制作用最为显著的载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-SR_4与pDNOR221和plenti6/V5-DEST连接，构建plenti6/V5慢病毒表达载体。重组慢病毒转染BGC823细胞72h后，将培养皿放在荧光显微镜下观察，几乎所有细胞GFP蛋白表达呈阳性。经RT-PCR和Western Blot验证与原始BGC823及阴性对照细胞系Lenti-CDH17-miR-neg相比，沉默细胞中CDH17的表达明显减少。经6μg/ml Blasticidin（杀稻瘟菌素）抗生素筛选实验，用3μg/ml Blasticidin对慢病毒转染的细胞进行维持，最终构建能够稳定沉默CDH17表达的胃腺癌细胞系Lcnti-CDH17-miR-B。 3.体外实验表明，CDH17沉默后，BGC823细胞增殖、迁移能力减弱，细胞周期阻滞于G0/G1期[BGC823、lenti-CDH17-miR-neg和lenti-CDH17-miR-B细胞中G0/G1期细胞百分数(％)分别为57.4±2.32、60.7±2.40和72.5±1.65，P＜0.05]，western blot检测表明CDH17沉默后细胞周期蛋白cyclin-D1表达减少而cyclin-E增加。同时凋亡细胞百分数增加[BGC823、lenti-CDH17-miR-neg及lenti-miR-CDH17-B发生凋亡的细胞比率(％)分别为0.720±0.085、0.767±0.110和1.947±0.391，P=0.001]。裸鼠原位移植瘤实验表明，沉默CDH17表达后，BGC823细胞成瘤能力减弱，发生肝脏、肺脏转移的比率明显降低。同时瘤内注射实验表明，观察期末，CDH17-RNAi-Lentivirus注射组皮下移植瘤的体积[(1.2600±0.21652)cm3]和重量[(7.0638±1.06035)g]均小于生理盐水注射组[体积:(1.6967±0.14706)cm3，重量(8.1353±1.14351)g]和GFP-Lentivirus注射组[体积:(1.80830±0.25895)cm3，重量(4.7853±1.25603)g](P＜0.05)。免疫组织化学染色表明前者移植瘤中CDH17表达量明显低于后两者。TUNEL实验表明CDH17-RNAi-Lentivirus注射组移植瘤中凋亡细胞数量增加，提示CDH17-RNAi-Lentivirus能够部分抑制肿瘤生长，这种抑制作用可能是通过促进肿瘤细胞凋亡引起的。 4.蛋白组学实验表明，CDH17沉默后，BGC823中有15种蛋白质表达量发生3倍以上变化，其中9个表达下调，如Nucleophosmin（NPM，核磷蛋白）、Tropomyosin alpha-3chain（TPM3，原肌球蛋白α-3链）、Glutathione S-transferaseP（GSTP1，谷胱甘肽S-转移酶P）、Alpha-enolase（ENOA，α-烯醇酶）等，6个上调，如Clathrin light chain A(CLCA，网格蛋白轻链A)、Interleukin-1alpha(IL1A，白细胞介素-1)、Vinculin（VINC，黏着斑蛋白）等。这些蛋白质广泛分布于细胞胞浆(30.3％)、胞核(12.12％)、胞膜(9.09％)等部位，具有细胞骨架(25％)、分子侣伴(25％)、细胞黏附分子(6.25％)、信号分子(6.25％)、核酸结合(6.25％)、裂解酶(6.25％)、激酶(6.25％)、氧化还原酶(6.25％)、转移酶(6.25％）、膜运输蛋白(6.25％)等重要的生理功能，提示CDH17可能是一种多功能蛋白质，它能与其他多种蛋白发生相互作用。 结论: CDH17高表达能上调胃癌细胞增殖和侵袭的生物学行为，在胃癌发生发展过程中可能具有促癌基因的作用，它可能通过与其他多种蛋白的相互作用促进胃癌的侵袭转移。 收起