摘要: 罗杰斯无性穗霉(Clonostachys rogersoniana)是一株分离自西藏林芝的冬虫夏草定殖真菌，能够产生结构新颖，具有多种生物活性的多硫代二酮哌嗪类化合物verticillins。多硫代二酮哌嗪(Epipolythiodioxopiperazines，ETPs)是一类主要由真菌产生的重要的... 展开 罗杰斯无性穗霉(Clonostachys rogersoniana)是一株分离自西藏林芝的冬虫夏草定殖真菌，能够产生结构新颖，具有多种生物活性的多硫代二酮哌嗪类化合物verticillins。多硫代二酮哌嗪(Epipolythiodioxopiperazines，ETPs)是一类主要由真菌产生的重要的活性次级代谢产物，其二酮哌嗪母核中含有硫桥。Verticillins是二聚体的ETP类化合物。由于该类化合物在罗杰斯无性穗霉中组分复杂，产量极低，并且只能够在大米培养基上产生，严重阻碍了该类化合物的开发和利用。揭示该类化合物的生物合成途径，不仅可以用来提高化合物的产量、优化化合物的组分以及改进发酵条件，同时也有望发现一些新的有活性的同系物，并为该化合物的结构修饰与改造、作用靶点、机制研究、以及药效与毒性评价奠定基础。 本研究以罗杰斯无性穗霉为研究材料，通过构建Fosmid基因组DNA文库，成功克隆得到了verticillin生物合成基因簇(ver)，并分析预测了基因簇中相关基因的功能，其中verP编码一个非核糖体肽合成酶，推测负责verticillin主骨架的合成。通过建立罗杰斯无性穗霉的遗传转化系统，我们对verticillin基因簇中各基因进行了逐一敲除。经大米培养基发酵，LC/MS检测发酵产物，发现该基因簇中包括verP在内的大多数基因突变株都不再产生verticillin，而verJ和verK基因敲除突变株中verticillin产量明显下降，verA突变株中verticillin产量与野生株相似。verP的遗传互补株能够恢复verticillin的产生。上述结果证明我们获得的ver基因簇负责verticillin的生物合成。我们通过生物信息学分析，对该基因簇中各基因的功能以及verticillin的生物合成途径进行了推测。此外，我们意外发现ΔverP菌株几乎丧失了产生分生孢子的能力，通过加入含有verticillin的发酵液提取物能够部分恢复其产孢，暗示着verticillin或其中间体在罗杰斯无性穗霉形态分化中起重要作用。 在对verticillin的生物合成基因簇研究过程中，我们发现ΔverM突变株发酵产物的HPLC图谱中产生了新的化合物峰。进一步对ΔverM的发酵产物进行分离纯化和鉴定，得到了两个NRPS-PKS杂合的新骨架化合物，我们将其分别命名为gliocladiosinsA和B。verM编码一个可能的氧甲基转移酶蛋白，蛋白序列分析却发现VerM除具有氧甲基转移酶AdoMet-Mtase结构域外，还具有DNA转录抑制子Winged helix-turn-helix结构域，暗示着VerM可能具有调控功能。在完成罗杰斯无性穗霉全基因组测序的基础上，我们对该菌中可能的79个次级代谢物生物合成基因簇进行了生物信息学分析，并对其中的6个含有PKS-NRPS的聚酮合酶-非核糖体肽合成酶编码基因进行了转录分析。发现氧甲基转移酶基因verM的缺失能够引起一个在野生株中沉默的NRPS-PKS基因簇的激活，推测该基因簇可能与gliocladiosins A和B的合成有关。 顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)是临床上重要的抗感染药物--头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)的工业生产菌株。我们实验室前期工作通过对顶头孢霉T-DNA插入突变库的筛选，获得了一个显著影响顶头孢霉CPC产生以及产孢的基因，命名为AcmybA。我们通过RNA-Seq对顶头孢霉野生型菌株(WT)、AcmybA基因高表达菌株(AcmybAOE)及其敲除菌株(ΔAcmybA)的转录组进行了分析，得到了上百个AcmybA可能的靶基因。我们对其中的具有显著差异的10个靶基因分别进行了高表达研究，其中1个靶基因的过表达与AcmybA的敲除效果一致。序列分析表明该基因编码一个可能的26S蛋白酶体亚基合成的转录激活因子，我们将该基因命名为AcRpn4，AcRpn4全长1911bp，推测产物由636个氨基酸组成。AcRpn4高表达菌株(AcRpn4OE)分生孢子与头孢菌素C产量显著升高，而敲除株（ΔAcRpn4）的分生孢子及头孢菌素C产量较野生型菌株相比显著降低。转录结果表明AcRpn4OE中分生孢子形成的关键基因AcbrlA的转录量急剧升高，头孢菌素合成相关基因pcbAB和cefD1的转录水平较野生型菌株也有所提高。上述结果表明，AcMybA通过影响AcRpn4的转录调控头孢菌素C的产生以及分生孢子的形成。 收起