摘要: 头孢菌素类药物是临床上主要的抗微生物感染药物之一,近年来市场占有率一直呈稳步上升趋势。生产这类抗生素的前体头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)是以顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)为原料制备的,其工业发酵需氧量高,工艺要求较高。 透明颤... 展开 头孢菌素类药物是临床上主要的抗微生物感染药物之一,近年来市场占有率一直呈稳步上升趋势。生产这类抗生素的前体头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)是以顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)为原料制备的,其工业发酵需氧量高,工艺要求较高。 透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin,VHb)是一种原核生物血红蛋白。研究表明,在Vitreoscilla中,VHb的表达受氧调控,在贫氧状态下表达量大大增加。本文将编码透明颤菌血红蛋白的结构基因vgb(Vitreoscilla Hemoglobin gene)引入头孢菌素C工业生产菌--顶头孢霉中,用于改善菌体对氧的需求,降低生产成本。 根据GenBank中报道的vgb序列,设计一对含KpnI和SacI酶切位点的引物,从质粒pMK4-LV中扩增得到vgb基因序列。使用KpnI和SacI双酶切vgb基因和表达载体pUCATPH,连接构建了重组质粒pUCATPH-LV,热激转化大肠杆菌DH5α后测序。测序结果表明插入序列没有发生突变。将质粒pUCATPH-LV转化大肠杆菌DH5α后,低氧诱导表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,成功表达出VHb。 采用玻璃纸平板法培养顶头孢霉菌丝体,培养4～5d,菌丝体用1％纤维素酶和1％蜗牛酶混合酶液30℃酶解3.5h,0.6mol/L KCl+25mmol/L CaCl2·2H2O作渗透压稳定剂,原生质体数量达到4.62×107个/mL,再生率为10.18％。原生质体电击转化法将重组质粒pUCATPH-LV转入顶头孢霉,利用潮霉素抗性筛选转化子,PCR证明vgb已成功转入顶头孢霉中。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明在低氧条件下VHb获得了表达,CO差光谱分析发现在420nm处有一个与对照明显不同的吸收峰,表明VHb具有生物活性,证明vgb已在顶头孢霉菌中表达。 本文还构建了重组质粒pCAMBIA1301-LV,拟通过农杆菌介导的遗传转化实现vgb基因在顶头孢霉中的克隆表达。根据质粒pCAMBIA1301的多克隆位点和GenBank中报道的vgb序列,设计一对含BamHI和SacI酶切位点的引物,从质粒pMK4-LV中扩增得到vgb基因序列。使用BamHI和SacI双酶切vgb基因和载体pCAMBIA1301,连接构建了重组质粒pCAMBIA1301-LV,热激法转化Eoli.DH5α后测序,结果表明插入序列与GenBank中报道的vgb序列一致。质粒pCAMBIA1301-LV冻融法转化农杆菌菌株LBA4404,为农杆菌介导真菌转化提供了前期基础。 本研究为头孢菌素C的菌种改造开辟了新思路,同时对于其它抗生素产生菌的基因工程改造工作具有理论和现实意义。 收起