摘要: 生物脱硫具有选择性高，反应条件温和等优点，是实现石油及其产品深度脱硫最有效的技术之一。生物脱硫要走向工业化应用必须提高已有脱硫微生物的催化活性。本论文工作针对本实验室分离的专一性脱硫微生物红平红球菌Rhodococcus erythropolis LSSE8-1... 展开 生物脱硫具有选择性高，反应条件温和等优点，是实现石油及其产品深度脱硫最有效的技术之一。生物脱硫要走向工业化应用必须提高已有脱硫微生物的催化活性。本论文工作针对本实验室分离的专一性脱硫微生物红平红球菌Rhodococcus erythropolis LSSE8-1，利用代谢工程的手段提高其脱硫活性。 对专一性脱硫微生物脱硫相关基因的保守性进行了研究。根据R.erythropolisIGTS8脱硫基因的保守区设计引物，PCR扩增得到了Bacillus brevis R-6和Pseudomonas delafleldii R-8的脱硫相关基因。测序结果表明与IGTS8的相关脱硫基因相似性在99%以上。以上结果表明专一性脱硫菌株脱硫基因高度保守。 在大肠杆菌中高效表达出了有活性的脱硫基因的重组蛋白，研究了单个脱硫相关基因的功能。分别构建了脱硫相关基因的表达质粒pET-21a-dszA、pET-28a-dszB和pET-28a-dszC。转化E.coli BL21(DE3)。经过IPTG诱导表达后的全细胞蛋白SDS-PAGE结果表明dzsA、dszB和dszC得到了高效表达。通过对三株重组菌的无细胞粗提液代谢产物的HPLC检测，证实了表达出来的融合蛋白具有一定的催化活性。 通过提高脱硫相关基因的拷贝数和加强氧化还原酶基因dszD的表达，得到了脱硫活性提高的重组菌Rhodococcus sp. LSSE8-2和LSSE8-3和LSSE8-4。Rhodococcus sp. LSSE8-4是携带有dszD的表达质粒的重组菌。当以二苯并噻吩(DBT)为硫源时，重组菌株Rhodococcus sp. LSSE8-2和LSSE8-3的脱硫活性差别不大，都高于原始菌LSSE8-1；但是当以硫酸盐为硫源时，Rhodococcus sp。LSSE8-2的脱硫活性大大降低而LSSE8-3的脱硫速率仍然维持在一定水平。Rhodococcus sp. LSSE8-4在脱硫后期才表现出较高的2-羟基联苯(2-HBP)生成速率。在脱硫反应的终点，Rhodococcus sp. LSSE8-4的2-HBP生成量为1.54 mM，高于原始菌的1.3 mM。对于起始硫含量为497 mg L-1的柴油，经过4 h重组菌Rhodococcus sp.LSSE8-3能将柴油中的大约82%的硫脱除，而原始菌只能脱除其中61%的硫。 利用vgb在R.erythropolis LSSE8-1异源表达，得到了生长状况和脱硫活性都得到改善的重组菌株。重组菌的CO差光谱在419nm处有特征峰出现，表明vgb在脱硫菌中得到了有效的表达。重组菌和原始菌相比，相同培养条件下可以获得更大的生长量，在培养的后期，OD600达到12.6，而原始菌为10.4。在DBT模拟油相脱硫实验中，重组菌在正常条件和低溶氧条件下均表现出较高的脱硫活性。在实际柴油的脱硫过程中，重组菌能脱除硫含量为261.3mg L-1柴油中73%的硫，而在相同条件下原始菌Rhodococcus sp. LSSE8-1脱硫率为62%。 在Rhodococcus sp. LSSE8-1中引入功能已知的、来源于芳香族化合物降解菌株Rhodococcus sp. RHA1的双组分信号转导系统BphS/BphT，得到了脱硫基因的表达受脱硫终产物2-HBP诱导的重组菌株LSSEB-5。为了更加合理地设计实验，建立了脱硫基因的表达受BphS/BphT表达的数学模型。通过对Rhodococcussp. LSSEB-5的报告基因绿色荧光蛋白GFP的荧光强度的测定，定量地研究了这种产物诱导型的基因回路中基因表达的动力学行为。与增加了脱硫基因拷贝数的重组菌Rhodococcus sp. LSSE8-2相比，LSSEB-5表现出更高的脱硫活性。 本论文工作不仅得到了多株脱硫活性得到提高的R.erythropolis LSSE8-1重组菌，而且对于将来进一步利用基因工程的手段改造脱硫微生物和构建新型表达载体也具有借鉴作用。 收起