摘要: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前体分子β—烟酰胺单核苷酸（NMN），因其被认为具有抗衰老的活性近年来备受关注。NMN天然存在于生物细胞中，但其含量极少且纯化困难。目前，合成NMN的方法有两种：化学合成和生物合成。化学合成的成本较高，同时存在副... 展开 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前体分子β—烟酰胺单核苷酸（NMN），因其被认为具有抗衰老的活性近年来备受关注。NMN天然存在于生物细胞中，但其含量极少且纯化困难。目前，合成NMN的方法有两种：化学合成和生物合成。化学合成的成本较高，同时存在副产物多、安全性低等问题。相比之下，生物合成法（酶法和发酵法）更为绿色和安全。酶法合成NMN的方法已经较为成熟，且具有较高的收率，但其所需的核糖和ATP等底物成本相对较高。相比之下，发酵法利用烟酰胺和葡萄糖等低成本底物合成NMN，具有工业化大规模合成的潜力。发酵法通常采用大肠杆菌作为生产菌株，但这种方法存在一定的安全隐患。使用酿酒酵母作为生产菌株是更加安全环保的生产方法。因此，本研究以酿酒酵母为生产菌株，采用基因工程策略改造酿酒酵母，使改造后的酵母具有一定的NMN生产能力，为生产更高质量的NMN产品提供有力支持。 （1）首先，构建酵母单基因表达菌株。应用基因工程方法将密码子优化后的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因（Nampt）和烟酰胺转运蛋白基因（NiaP）以及NMN转运蛋白基因（PnuC）分别导入酿酒酵母，得到三个基因的酵母单基因表达菌株；摇瓶发酵结果显示三个基因都分别在诱导型启动子（GAL1）和组成型启动子（PGK1）的作用下明显提高了NMN在酵母中的产量，其中诱导型启动子作用的Nampt单基因表达菌株（pESC-Nampt-TRP）的产量最高，摇瓶发酵24h达到49.13mg/L的NMN。 （2）然后，构建酵母多基因表达菌株。将三个基因两两组合，应用基因工程方法将双基因组合载体导入酿酒酵母中得到双基因酵母表达菌株，摇瓶发酵结果显示双基因组合表达菌株分别在组成型启动子（PGK1和TDH3）和诱导型启动子（GAL1和GAL10）的作用下明显提高了NMN在酵母中的产量，其中诱导型启动子作用的Nampt和PnuC的组合表达菌株（pESC-Nampt-PnuC-TRP）的产量最高，摇瓶发酵21h达到50.43mg/LNMN；将三个基因连入同一个载体，再将其导入酿酒酵母细胞得到三基因表达菌株(pESC-Nampt-PnuC-NiaP-TRP)，结果显示该菌株摇瓶发酵24h的NMN产量为50.07mg/L。 （3）优化改造后酿酒酵母的摇瓶发酵条件。选择上述实验改造得到的NMN生产效率最高的酿酒酵母菌株pESC-Nampt-PnuC-TRP进行摇瓶发酵。摇瓶发酵实验中通过优化发酵时间，底物浓度，诱导剂浓度和加入柠檬酸钠强化磷酸戊糖途径的方法进一步提高该菌株生产NMN的能力。最终该菌株在3g/L的烟酰胺底物浓度，0.5g/L的柠檬酸钠和2%的半乳糖诱导剂的作用下，摇瓶发酵20h得到52.26mg/L的NMN产量。 收起