摘要: 随着世界范围内石油储量的迅速减少，能源危机和环境污染已成为各国普遍存在的问题。发展可再生、安全、廉价的替代能源燃料乙醇不仅可以缓解能源危机，还可以显著改善生态环境，具有良好的经济和社会效益。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)被广泛... 展开 随着世界范围内石油储量的迅速减少，能源危机和环境污染已成为各国普遍存在的问题。发展可再生、安全、廉价的替代能源燃料乙醇不仅可以缓解能源危机，还可以显著改善生态环境，具有良好的经济和社会效益。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)被广泛应用于生物乙醇的发酵生产。近年来通过对酿酒酵母进行基因改造以提高乙醇产量成为研究热点。 酿酒酵母中有五个基因adh1-adh5编码与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶(Adh1p-Adh5p)，其中除Adh2p催化将乙醇氧化为乙醛的反应外，其他四种乙醇脱氢酶Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p在葡萄糖发酵过程中还原乙醛生产乙醇，当外界环境中的葡萄糖被耗尽后Adh2p负责催化利用乙醇作为碳源的初始反应，而Adh1p在乙醛生成乙醇的过程中发挥着最为关键的作用。因此，阻断Adh2p催化的乙醇分解代谢支路，同时增强Adh1p的作用极有可能提高酿酒酵母发酵产乙醇的能力。 本课题组已成功地敲除了酿酒酵母adh2基因，在此基础上，利用重叠延伸PCR融合磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)启动子和酿酒酵母乙醇脱氢酶基因Ⅰ(alcohol dehydrogenaseⅠ，adh1)，将该融合片段插入带有G418抗性基因(KanMX)和loxP位点的pUG6质粒中，并在adh1基因下游插入细胞色素c(Cytochrome c transcription，CYC1)终止子，构建了酿酒酵母整合表达载体pUPGKAT。Tth111 Ⅰ内切酶线性化后转化酿酒酵母乙醇脱氢酶基因Ⅱ(adh2)敲除菌株YS2-△adh2。根据酿酒酵母同源重组机制，使adh1基因增加一个拷贝，且其中一个拷贝置于PGK强启动子下游。分别提取YS2-△adh2和YS2-△adh2-adh1总RNA并进行SYBR Green荧光定量PCR检测。结果表明超表达突变菌株YS2-△adh2-adh1乙醇脱氢酶Ⅰ的mRNA是出发菌株YS2-△adh2的4.08倍。在PGK启动子调控下，乙醇脱氢酶Ⅰ基因成功实现超表达。厌氧发酵试验表明该重组菌株YS2-△adh2-adh1的乙醇产量较出发菌株提高了8.84％。 收起