摘要: 目的：制备一种新型的地塞米松-Avastin超分子水凝胶，在明确理化性质及眼部生物相容性的基础上，观察其对角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的抑制作用及机制，为眼前段的药物传递及CNV的临床治疗提供一种新的途径。 方法：⑴以α-... 展开 目的：制备一种新型的地塞米松-Avastin超分子水凝胶，在明确理化性质及眼部生物相容性的基础上，观察其对角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的抑制作用及机制，为眼前段的药物传递及CNV的临床治疗提供一种新的途径。 方法：⑴以α-环糊精（α-cyclodextrin，α-CD）为主体与甲氧基聚乙二醇-聚己内酯（Methoxy polyethylene glycol-poly（ε-caprolactone），MPEG-PCL）双亲性嵌段共聚物胶束自组装形成超分子水凝胶，并包载地塞米松磷酸（Dexamethasone Sodium Phosphate，Dexp）及Avastin（Ava）。扫描电子显微镜观察水凝胶内部结构；流变及红外光谱研究了药物对水凝胶结构及表征的影响；药物体外释放实验研究超分子水凝胶分别对Dexp及Ava的缓控释效果。⑵CCK8法检测Dexp-Ava超分子水凝胶中的载体及药物对角膜上皮细胞（Human Corneal Epithelial Cells，HCEC）的毒副作用；细胞划痕实验观察Dexp-Ava超分子水凝胶对HCECs迁移能力的影响；改良的德雷兹染眼试验（Draize test）了解超分子水凝胶载体在活体眼前段的生物相容性。⑶建立碱烧伤诱导的大鼠CNV模型，分别使用Dexp-Ava超分子水凝胶、单一药物超分子水凝胶及单一药物滴眼液局部点眼治疗重度角膜碱烧伤。在烧伤第3日行炎症指数评估；烧伤第7日及14日行CNV面积测算，烧伤第3日及14日取大鼠眼球行HE染色观察组织结构及免疫荧光法检测各组角膜中CD31、VEGF、α-SMA的表达；烧伤第7日取大鼠角膜行Western Blot检测VEGF的表达。此外，还通过Cy3标记的驴抗人IgG标记Ava,用免疫荧光法检测Dexp-Ava超分子水凝胶、Ava超分子水凝胶组及Ava液组不同时间点Ava在角膜的分布。 结果：①扫描电子显微镜显示Dexp-Ava超分子水凝胶具有三维立体结构，并具有典型的胶束超分子水凝胶疏松多孔的特征。傅里叶红外光谱检测空白超分子水凝胶、Dexp超分子水凝胶、Ava超分子水凝胶及Dexp-Ava超分子水凝胶冻干粉末所得红外图谱，对比空白超分子水凝胶和包载药物超分子水凝胶的结果，可见没有新的吸收峰出现。流变学检测结果示在体表温度下（37℃），各组超分子水凝胶的储能模量（G’）始终大于耗损模量（G”）；在频率发生变化时，各组储能模量（G’）始终大于耗损模量（G”），存储模量（G’）及损耗模量（G”）并未随频率的变化而变化。根据 ELISA及HPLC结果， Dexp-Ava超分子水凝胶中的Ava及Dexp检测到的释放量均达到70%以上，体外释放早期Dexp有突释现象，而Ava持续缓慢释放。②CCK8检测结果示：空白超分子水凝胶载体浓度达到20mg/ml时，细胞存活率仍达85%以上，且细胞存活率并未随载体浓度升高而下降；Ava浓度达到6.25mg/ml及Dexp到达5mg/ml时，细胞存活率仍达70%以上。角膜划痕实验结果示各组角膜上皮细胞迁移率与对照组相比无明显差异（p＞0.05）。Draize test结果示：裂隙灯检查未见眼前段明显刺激症状；角膜荧光素钠染色示角膜上皮无明显缺损；HE染色角膜各层形态结构正常。③Dexp-Ava超分子水凝胶组炎症指数明显低于Ava超分子水凝胶及Ava液组（p＜0.001， p＜0.001），与Dexp超分子水凝胶组及Dexp液组相比，差异也具有统计学意义（p=0.033， p=0.004）；Dexp-Ava超分子水凝胶组与Ava液及Dexp液组相比，CNV面积均有显著差异（p＜0.001，p＜0.001），与Ava超分子水凝胶组相比，CNV面积差异亦具有统计学差异（p=0.008）；HE染色结果示角膜碱烧伤后第3日Dexp-Ava超分子水凝胶的炎症反应及14日的CNV生长程度均好于其他各治疗组。免疫荧光结果示Dexp-Ava超分子水凝胶组较其他组更有效地抑制了VEGF和CD31的表达，未见α-SMA表达。Western Blot结果示各超分子水凝胶组均较滴眼液组能够使药物更有效地抑制VEGF的表达。另外，Cy3标记的驴抗人 IgG标记Ava，不同时间点行角膜免疫荧光检测，结果示随着时间推移，Ava液组荧光迅速减弱，2h时已与阴性对照组无明显差异。而Dexp-Ava超分子水凝胶组及Ava超分子水凝胶组在24h时在角膜浅基质层仍可见较强荧光。 结论：⑴Dexp-Ava超分子水凝胶的三维网络结构稳定，可在一定程度上对抗泪液冲刷及鼻泪管的引流，延长眼表滞留时间，同时在眨眼的剪切作用下可促进药物释放；包裹于水凝胶内的药物结构及活性不受载体的影响；随着超分子水凝胶网络降解破坏的过程，水凝胶中的Dexp和Ava缓慢而可控地释放。⑵Dexp-Ava超分子水凝胶对HCECs无毒副作用，对HCECs迁移能力无影响；MPEG5000-PCL5000与α-CD形成的超分子水凝胶药物载体应用于眼表时，在眼前段具有良好的生物相容性，是较为安全的眼部药物传递系统。⑶Dexp-Ava超分子水凝胶组在角膜急性炎症期抑制炎症效果在各治疗组中最佳；Ava超分子水凝胶组及Dexp超分子水凝胶组抑制CNV的效果分别优于Ava液组及Dep液组，Dexp-Ava超分子水凝胶组在各治疗组中疗效最佳。Dexp-Ava超分子水凝胶组、Ava超分子水凝胶组及 Dexp超分子水凝胶组均能有效抑制 VEGF的表达，Dexp-Ava超分子水凝胶组的抑制作用可能更强。Dexp-Ava超分子水凝胶组、Ava超分子水凝胶组及Dexp超分子水凝胶组可能下调了α-SMA的表达，促进CNV回退。 收起