摘要: 阿尔兹海默症（AD）是发生在老年期及老年前期的一种慢性退化性脑变疾病，以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变为临床表现。在人口老龄化的当代社会，AD成为继心脑血管疾病，肿瘤和脑卒中的第四大杀手，威胁着老年人身体健康，降低了生活质量，加重... 展开 阿尔兹海默症（AD）是发生在老年期及老年前期的一种慢性退化性脑变疾病，以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变为临床表现。在人口老龄化的当代社会，AD成为继心脑血管疾病，肿瘤和脑卒中的第四大杀手，威胁着老年人身体健康，降低了生活质量，加重家庭和社会负担。AD发病原因复杂多样，目前具体发病机制仍不明确。 近年研究发现，神经炎症反应是AD的一个重要的致病原因。AD患者脑内小胶质细胞（MG）高度活化，炎性因子含量增高。作为神经炎性的始作俑者，MG免疫功能的调控成为AD治疗的新靶点，其免疫功能的研究也跻身于神经退行性疾病领域的研究热点。MG在CNS中的作用是把双刃剑，激活的MG吞噬细胞残渣，通过抗原递呈功能、细胞因子分泌参与免疫应答反应，移除病原体。然而，MG过度激活导致CNS发生慢性炎症，加重大脑损伤。因此，严格调控MG免疫反应是防止神经炎性发生的关键。 乙酰胆碱是一类参与中枢大脑学习、认知、记忆等的重要神经递质，乙酰胆碱作用的受体包括毒蕈碱型胆碱受体（mAChRs）和烟碱型胆碱受体（nAChRs）。近年来研究表明，乙酰胆碱系统中nAChRs在MG介导的神经炎性发挥作用，а7烟碱型受体（а7nAChR）在MG表达，激活а7nAChR抑制MG的炎性反应。然而，mAChRs在MG的表达情况以及是否参与MG的炎性调控尚不清楚。本实验室前期研究发现，SD大鼠长期腹腔注射mAChRs非选择性拮抗剂盐酸苯海索（THP）促进大脑海马和皮层的MG增生和激活，上调MG的CD68表达同时伴随M1受体表达增加，并且两者存在共定位，暗示M受体介导THP对MG活化的调控作用。在本研究中，将首次确证mAChRs在MG的表达情况，并且观察mAChRs对MG免疫应答功能的调控作用。本研究的开展利于探讨mAChRs与神经炎性的关系，开拓了其影响AD发展的新机制研究,有利于寻找治疗AD的新靶点。 首先建立原代大鼠皮层小胶质细胞培养方法，在体外条件下，确证mAChRs在小胶质细胞表达情况；利用mAChRs非选择性激动剂氧化震颤素（OX）、mAChRs非选择拮抗剂阿托品和M1受体阻断剂毒蕈碱毒素7（MT7）三种工具药，研究mAChRs对小胶质细胞抗原递呈功能、小胶质细胞活化和免疫炎症介质释放的调控作用。 方法： （1）建立大鼠皮层原代小胶质细胞培养方法：将出生12 h内的SD大鼠的皮层神经胶质细胞混合培养8-9天，小胶质细胞分层明显且数量达到最多，利用胰酶温和消化法和震摇法进行小胶质细胞分离纯化；纯化的小胶质细胞培养3天后基本恢复静息状态，通过小胶质细胞标记分子Iba1免疫荧光染色进行鉴定。 （2）mAChRs在小胶质细胞表达研究：利用RT-PCR、Western-blot技术从mRNA和蛋白水平检测mAChRs在小胶质细胞表达情况。 （3）mAChRs对小胶质细胞抗原递呈功能影响研究：mAChRs非选择性激动剂OX处理小胶质细胞，利用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）结合免疫荧光、流式细胞术观察OX对主要组织相容性抗原分子Ι（MHCΙ）表达影响；荧光定量PCR检测OX对小胶质细胞抗原递呈分子相关基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表达影响。 （4）M1受体参与mAChRs调控小胶质细胞抗原递呈作用研究：利用M1受体阻断剂MT7，应用免疫荧光结合CLSM、Western-blot和荧光定量PCR检测MT7对小胶质细胞MHCΙ分子和M1受体表达的变化。 （5）mAChRs对小胶质细胞活化的影响：免疫荧光结合CLSM和Western-blot检测OX单独给药以及MT7和OX伴随给药对小胶质细胞激活分子CD68和CD11b表达影响。 （6）mAChRs对小胶质细胞炎症介质释放影响：Luminex技术检测OX对小胶质细胞IL-1β、TNF-а和IL-10释放的影响。 结果： （1）改进了原代小胶质细胞的培养方法，小胶质细胞Iba1阳性率高达95%；观察了小胶质细胞生长规律，神经胶质细胞混合培养时小胶质细胞呈现阿米巴样，分离纯化3天后基本恢复分枝状； （2）RT-PCR结果表明，mAChRs五种亚型受体mRNA均在小胶质细胞表达，免疫荧光结合CLSM分析和Western-blot结果显示M1受体表达于小胶质细胞，并且定位在胞膜和胞浆； （3）免疫荧光结合CLSM分析发现，正常组小胶质细胞MHCΙ表达量较少，OX（10-5 M）与小胶质细胞共同孵育72 h，MHCΙ表达显著上调； （4）流式细胞术结果表明，正常组小胶质细胞膜共标记MHCΙ和β2m的细胞阳性率为8.46±0.47%，OX组β2m和MHCΙ共标记细胞阳性率为51.80±1.48%，与正常组比较，OX组显著增加了5倍，表明OX促进小胶质细胞膜功能性MHCΙ表达； （5）荧光定量PCR结果发现，OX促进抗原递呈分子相关基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表达； （6）免疫荧光结合CLSM分析表明，OX（10-5 M，40 min）同时上调小胶质细胞MHCΙ和M1受体表达，MT7（10-8 M）预处理小胶质5 min，部分阻断OX诱导的MHCΙ和M1受体表达；并且M1受体与MHCΙ存在共定位，提示M1受体参与OX上调MHCΙ表达； （7）OX动态影响小胶质细胞M1受体表达：CLSM结合Western-blot结果显示， OX（10-5M，72 h）上调M1受体表达;荧光定量PCR结果表明，OX（10-5M，20 min）抑制M1受体mRNA表达, OX（40 min和72 h）促进M1受体mRNA表达，MT7部分阻断OX诱导的M1受体mRNA表达； （8）CLSM分析和western-blot结果显示，OX（10-5 M，72 h）上调小胶质细胞激活分子CD68和CD11b表达，表明OX促进小胶质细胞活化；MT7部分阻断OX对两者表达的诱导作用；提示M1受体直接调控小胶质细胞活化; （9）OX（10-6 M，10-4 M）与小胶质细胞共同孵育24 h，小胶质细胞TNF-а和IL-10释放减少，OX对IL-1β释放无明显影响。 结论： （1）成功改进了原代小胶质细胞培养方法，提高了小胶质细胞分离效率。 （2）mAChRs五种亚型受体mRNA均在大鼠皮层小胶质细胞表达，M1受体表达在小胶质细胞胞膜和胞浆。 （3）OX激动mAChRs，促进小胶质细胞抗原递呈功能，活化小胶质细胞并调控其炎性介质释放。 （4）阻断M1受体，抑制OX诱导的MHCΙ表达和小胶质细胞活化，提示M1受体在mAChRs调控小胶质细胞免疫应答作用中发挥重要作用。 收起