摘要: 第一部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究 目的： 体外分离培养人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）诱导分化为血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）。探讨人牙龈成纤维细胞（HGFs）在体外分化为血... 展开 第一部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究 目的： 体外分离培养人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）诱导分化为血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）。探讨人牙龈成纤维细胞（HGFs）在体外分化为血管内皮细胞（VEC）的潜能。 方法： 1牙龈组织的获取和分离 正常人牙龈组织取自河北医科大学口腔医院口腔颌面外科，患者下颌阻生齿拔除术。牙龈组织手术切取后带回实验室，在无菌条件下分离牙龈上皮及结缔组织，留取牙龈结缔组织进行细胞培养。 2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的培养 培养液选用含15%胎牛血清的L-DMEM。牙龈结缔组织剪成1 mm×1 mm的组织块，进行原代培养。培养的细胞达到80%融合后，进行细胞传代培养。 3人牙龈成纤维细胞（HGFs）的鉴定 3.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞（ HGFs），选择波形蛋白（vimentin）抗体和CD31抗体鉴定成纤维细胞和血管内皮细胞。 3.2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的RT-PCR鉴定 TRIzol法提取成纤维细胞的总RNA； 以分光光度计测定细胞总 RNA的纯度及浓度； 应用反转录试剂盒RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA； 以适量反转录所得的cDNA为模版，在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增； 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后置于凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，以GAPDH作为内参照校正，用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。 3.3人牙龈成纤维细胞（HGFs）免疫细胞化学染色 采用鼠抗人vimentin单克隆抗体、鼠抗人III型胶原单克隆抗体，通过免疫细胞化学染色法检测vimentin蛋白和III型胶原蛋白在人牙龈成纤维细胞中的表达与分布。 3.4人牙龈成纤维细胞（HGFs）免疫荧光染色 采用兔抗人S-100A4抗体和鼠抗人肌动蛋白α（α-SMA）抗体，通过免疫荧光染色法检测 S-100A4蛋白和α-SMA蛋白在人牙龈成纤维细胞HGFs中的表达与分布。 4生长曲线的测定 采用MTT法测定第1~6代人牙龈成纤维细胞（HGFs）1~7天的OD490 nm处的吸光值。 5内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（HGFs）中的表达 采用vimentin，血管生成素受体2（tie2）抗体和血管生长因子受体2（VEGFR2）抗体，通过Western blot半定量vimentin蛋白，tie2蛋白和VEGFR2蛋白在不同VEGF165浓度组和不同诱导周期组中的表达量。 Real-time PCR相对定量法检测不同VEGF165浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因，tie2基因，血管生成素2（Ang2）基因的mRNA相对表达量。 6诱导过程中的形态学观察 倒置显微镜观察8 ng/ml VEGF165诱导人牙龈成纤维细胞（HGFs）0，7，14，21，28，35，42和50天时的形态学变化。 7诱导后血管内皮样细胞的鉴定 7.1免疫细胞化学染色 8ng/ml VEGF165诱导人牙龈成纤维细胞35天后，采用鼠抗人 CD34单克隆抗体、鼠抗人 CD31单克隆抗体，通过免疫细胞化学染色法检测CD34蛋白和CD31蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。 7.2免疫荧光染色 8ng/ml VEGF165诱导人牙龈成纤维细胞35天后，采用血管性假血友病因子（vWF）抗体和上皮钙粘附分子（E-cadherin）抗体，通过免疫荧光染色检测vWF蛋白和E-cadherin蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。 7.3 RT-PCR鉴定诱导后血管内皮样细胞中tie2基因的mRNA相对表达量。 7.4经8 ng/ml VEGF诱导35天后，通过透射电镜观察诱导后血管内皮样细胞的超微结构。 8流式细胞仪测定诱导细胞转化率 采用CD34抗体和CD31抗体，通过流式细胞仪检测诱导后血管内皮细胞中CD34和CD31的阳性表达率，以评估人牙龈成纤维细胞（HGFs）分化为血管内皮细胞（VEC）的转化率。 9成管能力测试检测诱导后血管内皮细胞的功能 将诱导前后细胞接种于24孔板的Matrigel基质胶中，Olympus IX71倒置显微镜下观察管状排列结构和完整度并计数管状结构的数量，对诱导后血管内皮细胞（VEC）的功能进行评估。 结果： 1人牙龈成纤维细胞（HGFs）的基本生长情况 细胞多数呈长梭形，细胞核较大，呈圆形或椭圆形。原代培养以组织块为中心向周围辐射生长，传代培养的细胞生长状态好，3~4天即可生长达90%~100%。 2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的鉴定结果 2.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞（HGFs）表面抗原vimentin和CD31表达结果 培养的成纤维样细胞表面抗原 vimentin表达阳性，阳性率为（97.13±0.62）%；而表面抗原 CD31表达率仅为（8.64±1.55）%。两者比较有统计学差异（P<0.05）。 2.2细胞RT-PCR鉴定结果 细胞 RT-PCR结果显示人牙龈成纤维细胞（ HGFs）特异性表达vimentin，S-100A4和α-SMA。然而，tie2在细胞中不表达。 2.3细胞的免疫细胞化学鉴定结果 鼠抗人vimentin单克隆抗体和鼠抗人III型胶原单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。 2.4细胞的免疫荧光染色鉴定结果 兔抗人S-100A4多克隆抗体和鼠抗人α-SMA单克隆抗体荧光染色结果显示细胞分别呈绿色荧光和红色荧光表达。 3人牙龈成纤维细胞（HGFs）生长曲线测定结果 结果显示第2代或第3代人牙龈成纤维细胞（HGFs）的对数生长期比其余代次细胞增殖水平显著升高（P<0.05），而第2代或第3代细胞的对数生长期细胞增殖水平无统计学差异（P>0.05）。 4内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（HGFs）中的表达 Western blot结果显示，8 ng/ml VEGF165诱导时tie2蛋白和VEGFR2的相对表达量最高。Real-time PCR结果显示，经8 ng/ml VEGF165诱导时tie2基因和Ang2基因的mRNA相对表达量达到最高。Western blot结果显示，诱导周期达到35天时tie2蛋白和VEGFR2蛋白的相对表达含量最高。Real-time PCR结果显示，诱导周期达到35天时tie2和Ang2基因的mRNA相对表达量最高。 5 VEGF165对诱导后细胞形态学的影响 人牙龈成纤维细胞（HGFs）经8 ng/ml VEGF165诱导7~14天，大部分细胞仍然呈现丛状或束状排列；14~21天时，细胞逐渐排列形成多边形上皮细胞样结构；21~28天时，细胞逐渐出现融合成簇现象，逐渐形成鹅卵石样或铺路石样的生长排列形式；28~35天时，绝大多数细胞呈现铺路石样的生长形式以及形成血管腔样结构。 6免疫细胞化学染色对诱导后细胞的鉴定 鼠抗人CD34单克隆抗体和鼠抗人CD31单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。 7 RT-PCR鉴定诱导后细胞tie2基因的表达 RT-PCR结果显示，与对照组相比，tie2基因在诱导后细胞中显著表达。 8免疫荧光染色对诱导后细胞的鉴定 兔抗人 vWF抗体和兔抗人 E-cadherin抗体荧光染色结果显示细胞分别呈红色荧光表达。 9诱导后细胞超微结构的观察 透射电镜观察显示，细胞表面呈现微绒毛结构，细胞胞浆内出现溶酶体结构及内皮细胞特有的Weibel-Palad小体（W-P小体）。 10流式细胞仪检测分析人牙龈成纤维细胞（HGFs）向血管内皮细胞（VEC）分化的转分化率 诱导后细胞组CD34和CD31细胞表型阳性率与对照组相比，差异有显著性，具有统计学意义（P<0.05）。 11成管能力测试实验比较诱导前后细胞形成小管的能力 诱导形成的细胞组在Matrigel基质胶中24小时呈现管状样结构，与对照组相比，诱导组成管数目显著增高，具有统计学差异(P<0.05)。 第二部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的研究 目的： 体外分离培养人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）并诱导分化为血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC），证实人牙龈成纤维细胞（ HGFs）具有在体外分化为血管平滑肌细胞（VSMC）的潜能。 方法： 1人牙龈组织的获取，分离和细胞的培养同第一部分。 2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的鉴定 2.1人牙龈成纤维细胞（HGFs）的RT-PCR鉴定同第一部分。 2.2人牙龈成纤维细胞（HGFs）免疫细胞化学染色同第一部分。 2.3人牙龈成纤维细胞（HGFs）免疫荧光染色同第一部分。 3生长曲线的测定同第一部分。 4平滑肌细胞相关标记物在诱导分化中的人牙龈成纤维细胞（HGFs）中的表达 采用波形蛋白（ vimentin），肌动蛋白α（α-SMA）和肌球蛋白（SM-MHC）抗体，通过Western blot半定量vimentin蛋白，α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白在不同PDGF-BB浓度组和不同诱导周期组中的表达量。 Real-time PCR相对定量法检测不同PDGF-BB浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因，α-SMA基因，SM-MHC基因，Calponin1（Cnn1）基因和平滑肌22α（SM22α）基因的mRNA相对表达量。 5诱导过程中细胞的形态学观察 倒置显微镜观察10 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（HGFs）0，7，14，21，28和35天时的形态学变化。 6诱导后细胞的鉴定 6.110 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（HGFs）28天后，采用兔抗人α-SMA抗体和鼠抗人SM-MHC抗体，通过免疫细胞化学染色法检测α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。 6.2采用Cnn1抗体和SM22α抗体，通过免疫荧光染色检测Cnn1蛋白和SM22α蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。 6.3 RT-PCR鉴定诱导后细胞中α-SMA基因和SM-MHC基因的表达量。 6.4经10 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（HGFs）28天后，通过透射电镜观察诱导后细胞的超微结构。 结果： 1人牙龈成纤维细胞（HGFs）的基本生长情况:结果同第一部分。 2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的鉴定 2.1细胞RT-PCR的鉴定 细胞特异性表达vimentin基因和S-100A4基因，弱表达α-SMA基因，不表达SM-MHC基因。 2.2细胞的免疫细胞化学鉴定:结果同第一部分。 2.3细胞 收起