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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 头颈部恶性肿瘤(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是常见的恶性肿瘤,主要包括口咽癌、喉癌、下咽癌、口腔癌、鼻咽癌等。人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)已被证实具有致癌性,持续感染高危型HPV-16/18是除过度吸烟和饮酒... 展开 头颈部恶性肿瘤(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是常见的恶性肿瘤,主要包括口咽癌、喉癌、下咽癌、口腔癌、鼻咽癌等。人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)已被证实具有致癌性,持续感染高危型HPV-16/18是除过度吸烟和饮酒外的另一个被确认的头颈鳞癌发病的独立危险因素。本课题中,我们采用高敏感度PCR扩增的方法,使用新鲜冰冻标本,检测HPV在头颈病变中的感染率,并进一步分析HPV阳性头颈部病变患者的临床特征。 第一章 头颈肿瘤中HPV感染的流行病学分析 第1部分头颈部病变中HPV的检测及临床特征分析 目的:检测头颈部病变组织中的HPV-DNA,分析HPV在头颈部病变中的感染情况,并分析HPV阳性头颈肿瘤的临床特性。 方法:收集自2013年7月至2014年4月于日本琉球大学耳鼻喉科门诊或病房治疗的头颈部病变患者的组织标本,共180例,包括头颈肿瘤163例,非肿瘤良性病变包括炎症以及非典型增生等14例,喉乳头状瘤3例。头颈肿瘤标本中包括头颈鳞癌83例,咽喉部腺瘤5例,头颈部淋巴瘤16例,原发不明癌7例,腮腺肿瘤29例,颌下腺肿瘤4例,外耳肿瘤8例。所有标本活检离体后立即储存于液氮中。提取上述组织标本的DNA,并评估DNA质量。使用两对HPV共通型引物GP5+/GP6+和MY09/MY11进行巢式PCR扩增检测HPV-DNA,分别选用HPV-16阳性细胞CaSki和HPV阴性细胞HNO41的DNA作为阳性对照和阴性对照。所有PCR阳性的扩增产物均需测序确定为HPV序列,并且与现有HPV亚型的序列比对,确定HPV亚型。 结果:经分析,HPV阳性头颈鳞癌患者的T分期较早,有统计学意义(P=0.034);HPV阳性头颈鳞癌患者中低年龄段患者(≤55岁)比例高于HPV阴性头颈鳞癌患者,差异处于有统计学意义的临界值(P=0.074)。 结论:喉乳头状瘤与HPV-6感染有明确相关性;部分头颈鳞癌与HPV感染相关,其中口咽癌最为密切,而喉癌与HPV感染关系尚不能确定;腮腺和甲状腺肿瘤与HPV感染无明显相关。 第2部分中国喉癌中HPV感染率及HPV感染与喉癌相关性的荟萃分析 目的:研究中国喉癌患者群体的高危型HPV-16/18感染率,并评估HPV-16/18感染与喉癌发病的相关性。 方法:检索各种常用中英文数据库,按照预先制定的方案筛选相关文献,共纳入22篇符合纳入标准的文献。根据研究开始前制定的方案提取相关数据。使用R3.0软件进行荟萃分析,分析喉癌患者中HPV-16/18的阳性率。进一步筛选病例-对照研究,共12篇文献符合纳入标准,提取相关数据,进行荟萃分析评估HPV-16/18感染与喉癌发病的相关性。 结果:喉癌患者中HPV-16/18阳性率的荟萃分析中,共提取到1477例喉癌病例,感染率为30.1%(95%CI:24.2%-36.8%)。评估高危型HPV-16/18感染的风险效应的荟萃分析中,一共提取到1040例喉癌病例和735例对照病例,喉癌组及对照组感染率分别为31.1%和5.0%,OR为8.07(95%CI:5.67-11.48),有统计学差异(P<0.001)。 结论:中国喉癌患者群体中有较高的HPV-16/18感染率;HPV-16/18的感染明显增加了中国人群中喉癌的发病风险。 第二章 HPV-16阳性肿瘤细胞和口咽鳞癌中HPV-16长调控区的甲基化状态分析 目的:检测HPV-16阳性肿瘤细胞株UM-SCC47,CaSki,SiHa细胞中HPV-16长调控区(LCR)的甲基化类型;检测与HPV感染关系最为密切的口咽鳞癌(OPSCC)组织标本中HPV-16 LCR内的CpG位点的甲基化状态。 方法:提取HPV-16阳性肿瘤细胞UM-SCC47,CaSki,SiHa细胞的DNA,提取本课题第一章检测以及本实验室前期检测的HPV-16阳性OPSCC组织标本的DNA,共19例。分析测序序列,获得甲基化的CpG(methylated CpG,meCpG)克隆出现的频率,计算每个CpG位点和LCR总体上的甲基化率。 结果:①分析测序序列,显示亚硫酸氢盐修饰彻底,通过测序可以获得每个CpG位点的甲基化情况。CaSki细胞、SiHa细胞和OPSCC标本的LCR区均有15个CpG位点,而UM-SCC47细胞的LCR区由于在nt7435和nt31处发生碱基变异,影响了该处CpG位点的存在,所以目标区域内共有13个CpG位点。②UM-SCC47和CaSki细胞的HPV-16 LCR均为高甲基化状态,整体甲基化率分别为79.8%(83/104)和90.0%(108/120),SiHa细胞则为完全非甲基化(0/120)。19例OPSCC标本的LCR区内CpG位点的平均甲基化率为13.1%(194/1481),总体上LCR区的甲基化可分为3种类型:高甲基化型(甲基化率≥30%),低甲基化型(5%-30%)和非甲基化型(甲基化率<5%)。③在UM-SCC47细胞和CaSki细胞中5'-LCR的CpG位点的甲基化率均高于Enhancer-Promoter区的甲基化率,分别为(91.7% vs.76.3%)和(100% vs.86.4%),由于进行测序的克隆数量的限制,差异均未达到显著统计学差异(P=0.147,P=0.063)。OPSCC标本中5'-LCR和Promoter区的甲基化率分别为14.6%(58/396)和16.5%(95/577),均高于Enhancer区的甲基化率8.1%(41/508),具有统计学差异(P=0.002,P<0.001)。④UM-SCC47细胞、CaSki细胞和OPSCC标本中,位于nt7862的CpG位点均呈现显著的低甲基化状态。在UM-SCC47和CaSki细胞内,除外位于E2BS-2内的CpG位点(nt7862),位于其他E2BSs内的CpG位点与位于E2BSs外的CpG位点相比均具有较高的甲基化率,分别为(97.9% vs.68.8%)和(100% vs.91.1%),均具有统计学意义(P<0.001,P=0.060),在OPSCC标本中也有类似的结果(17.5% vs.11.2%),有统计学意义(P=0.001)。 结论:HPV-16阳性肿瘤细胞中,在LCR区有两种以上的甲基化类型;OPSCC组织标本中,LCR区的平均甲基化率较低,但整体上仍存在明显不同的甲基化类型。 第三章 HPV-16 LCR内meCpG位点的去甲基化对HPV阳性头颈肿瘤细胞的影响 目的:研究去甲基化药物处理HPV-16阳性口咽鳞癌UM-SCC47细胞后,细胞的生物学特征以及癌基因E6和E7的变化;分析不同HPV-16阳性肿瘤细胞对逆转LCR区meCpG甲基化的不同生物学特性变化,探讨不同HPV-16阳性肿瘤细胞中可能不同的致癌机制,以及去甲基化作为HPV阳性细胞的治疗手段的可行性。 方法:①采用BSP和甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)两步扩增法来评估HPV-16 LCR区的总体甲基化状态;采用BSP法测定给予5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dc)处理后,3种HPV-16阳性肿瘤细胞LCR区CpG位点的甲基化状态变化;②提取细胞的总RNA,逆转录成cDNA;分别采用RT-PCR和实时荧光定量法(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)扩增GAPDH(或β-actin),E6和E7,分析HPV-16 E6和E7 mRNA的表达。qRT-PCR采用标准曲线相对定量法,不同标本间的E6和E7的相对表达量采用E6/β-actin和E7/β-actin进行比较;③采用细胞免疫组化检测HPV-16阳性细胞E6和E7的蛋白表达;④测定5-aza-dc对细胞生长的影响,采用MTS四唑化合物和台盼蓝溶液测定细胞增殖抑制情况;⑤用Annexin-V/7-AAD对细胞进行染色,根据染色情况得出细胞凋亡率;用碘化丙啶(PI)对细胞进行染色,检测细胞周期阻滞;⑥采用Lipofectamine RNAiMax转染siRNA沉默细胞的E6和E7表达,然后再测定细胞生物学特性的变化,包括细胞增殖抑制,细胞凋亡,细胞周期变化。 结果:LCR的去甲基化而引起的细胞生物学特性变化与E6和E7的表达下降有关。此外,5-aza-dc还可以导致UM-SCC47,CaSki细胞的S期阻滞以及SiHa细胞的生长抑制,考虑与药物的S-期阻滞特性以及细胞毒性有关。 结论:LCR区甲基化状态不同的2种HPV-16阳性肿瘤细胞对去甲基化处理表现出完全不同的反应,提示在HPV-16阳性肿瘤中,可能存在与LCR区甲基化状态相关的不同的肿瘤特性及致癌机制。此外,逆转LCR区内的meCpG位点甲基化状态,有可能作为治疗部分HPV阳性肿瘤患者的一种新疗法。 收起
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