摘要: 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)是红茶品质形成的关键因素，为此本课题选用PPO活性较高的“云大”凤庆种鲜叶为材料，经提取、分离纯化，得到两条PPO同工酶，并分别做了较全面的酶学特性研究。具体结果如下: (1)依据酶活力、Native-PAGE电泳图... 展开 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)是红茶品质形成的关键因素，为此本课题选用PPO活性较高的“云大”凤庆种鲜叶为材料，经提取、分离纯化，得到两条PPO同工酶，并分别做了较全面的酶学特性研究。具体结果如下: (1)依据酶活力、Native-PAGE电泳图等，优化确定凤庆PPO最佳提取条件:取适量茶鲜叶，以料液比1∶3(W/V)加入4℃预冷的柠檬酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH7.2)，和5％(g/mL) PVP冰浴研磨，浆液4℃浸提12h，9000 r/min，4℃离心30 min，取上清，得PPO粗酶液。 (2)制备的凤庆PPO粗酶液，经硫酸铵分级沉淀、离子交换层析（DEAE-SepharoseCL-6B）和凝胶过滤层析(Sephadex G-150)，分离纯化得到2条同工酶:PPOⅠ，约35 kDa的单一蛋白亚基，纯化倍数19.45; PPOⅡ，55-66.2 kDa的两个蛋白亚基结合体，纯化倍数30.18。 (3) PPO同工酶性质分析（以邻苯二酚为底物）:PPOⅠ和Ⅱ的最适反应温度均为40℃，最适pH分别为5.2、5.6，最适Cu2+浓度分别为0.5×10-7mol/L和1.00×10-7mol/L。抑制剂对凤庆PPOⅠ和Ⅱ的作用强弱次序:抗坏血酸＞亚硫酸钠＞EDTA＞半胱氨酸，抗坏血酸最高浓度时，酶活下降50％。凤庆PPO最适底物是邻苯二酚和焦没食子酸，可部分氧化没食子酸、对苯二酚，对间苯二酚作用最弱。酶动力学参数:以邻苯二酚为底物，PPOⅠ和Ⅱ的Km分别为4.42和3.46 mmol/L，PPOⅡ以焦没食子酸做底物的Km为3.46 mmol/L，但邻苯二酚的Vmax大于焦没食子酸，说明PPO与邻苯二酚亲和更强。 收起