摘要: 多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO，EC1.10.3.1)对茶叶加工以及茶树生理代谢都有着重要意义。作为茶叶中最受关注的酶蛋白之一，学者们对PPO的研究从未间断，但多是以含有多条同工酶的粗酶为研究对象，缺乏对茶树PPO单一同工酶的酶学性质以及茶黄素... 展开 多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO，EC1.10.3.1)对茶叶加工以及茶树生理代谢都有着重要意义。作为茶叶中最受关注的酶蛋白之一，学者们对PPO的研究从未间断，但多是以含有多条同工酶的粗酶为研究对象，缺乏对茶树PPO单一同工酶的酶学性质以及茶黄素类(Theaflavins，TFs)合成方面的研究。本课题以高PPO活性的勐库大叶种为材料，分离纯化获得2条PPO单一同工酶（PPOI-1、PPOI-2），并对PPO粗酶以及两个同工酶的酶学性质、TFs合成条件及合成效果差异进行分析比较，为阐明滇红品质形成机理和规模化制备TFs提供基础，主要结果如下： 勐库大叶种PPO粗酶、单一同工酶PPOI-1和PPOI-2在酶学特性方面差异显著。勐库大叶种PPO粗酶的最适pH为4.0，而PPOI-1、PPOI-2分别以pH4.0-4.4、pH4.8条件下的活性最高。勐库大叶种PPO粗酶、PPOI-1以及PPOI-2的最适温度分别为40-45℃、45℃和37℃。随着温度的提高，勐库大叶种PPO的热稳定性显著降低，但三者在20-30℃范围内均能长时间保持着较高的催化活性。此外，勐库大叶种PPO粗酶较单一PPO同工酶具有更强的耐抑制能力，而各抑制剂中以Na2SO3的抑制效果最强，乙二胺四乙酸二钠的抑制作用最弱。Cu2+可促进勐库大叶种PPO活性，而Na+则表现一定的抑制效应，Mg2+和K+对PPO粗酶和单一同工酶活性的影响差异显著。在底物特异性方面，勐库大叶种PPO粗酶、PPOI-1以及PPOI-2均仅对邻苯二酚和焦性没食子酸表现出催化活性，且都对后者具有更强的亲和性，而以间苯二酚、对苯二酚和没食子酸为底物时未能检测到酶活性。 分析了不同因素对勐库大叶种PPO粗酶、PPOI-1和PPOI-2合成TFs的影响，发现它们催化合成TFs的最适pH、最适温度接近，但最适底物浓度以及反应时间差异明显。勐库大叶种PPO粗酶和PPOI-1合成TFs的最适pH为4.0，而PPOI-2以pH4.4条件下的TFs含量最高。三者酶促合成TFs的最适反应温度均为37℃。勐库大叶种PPO粗酶、PPOI-1以及PPOI-2合成TFs的最适茶多酚浓度依次降低，分别为4.5mg/mL、3.0mg/mL和2.0mg/mL。在反应时间上，PPO粗酶催化反应1.0h已达到TFs最大积累量，而PPOI-1、PPOI-2的最适反应时间为2.5h。但无论是勐库大叶种PPO粗酶还是两个PPO单一同工酶，在更为偏酸以及较高的温度条件下均能保持较强的TFs合成能力，更加适应红茶发酵过程中pH和温度的变化，这可能是滇红品质优异的重要原因。此外，PPOI-1和PPOI-2可能是勐库大叶种发酵后期起主导作用的PPO同工酶，并可能是决定勐库大叶种适制红茶的因子之一。 在最适条件下，PPOI-1的TFs产量最高，可达577.32±6.28μg/mL，勐库大叶种PPO粗酶和PPOI-2的TFs产量则较为接近，分别为461.12±15.01μg/mL和479.51±5.13μg/mL。但PPOI-2的TFs转化率却是三者中最高的，为35.83±0.38%。勐库大叶种PPO粗酶、PPOI-1以及PPOI-2均对酯型儿茶素具有更强的催化活性，催化合成酯型茶黄素为主，且以茶黄素-3,3''-双没食子酸酯（Theaflavin-3,3''-digallate，TFDG）的比例最高，三者的TFDG含量分别占其TFs产量的51.84±1.70%、58.21±1.74%和60.77±1.55%。在催化过程中还伴随着表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）和没食子酸（Gallicacid，GA）的生成，有利于TFs的合成积累，这可能与滇红优异品质形成有关。 收起