摘要: 目的:体外合成X连锁调亡抑制蛋白(XIAP)基因编码区序列,将其插入空载体pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP原核表达载体,获得高产量、高纯度的TAT-XIAP目的蛋白,蛋白复性后并研究融合蛋白TAT-XIAP的生物学活性。 方法:体外合成大鼠 XIAP基因编码区序列,将其... 展开 目的:体外合成X连锁调亡抑制蛋白(XIAP)基因编码区序列,将其插入空载体pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP原核表达载体,获得高产量、高纯度的TAT-XIAP目的蛋白,蛋白复性后并研究融合蛋白TAT-XIAP的生物学活性。 方法:体外合成大鼠 XIAP基因编码区序列,将其插入 pTAT-HA质粒,构建重组表达载体pTAT-XIAP,Nco I和 Xho I酶对 pTAT-XIAP质粒 DNA进行双酶切并测序无误后,将 pTAT-XIAP重组表达载体转入大肠埃希氏菌(E.coli)表达菌株 BL21plysS。随机挑取阳性克隆的单菌落,接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜,当OD600=0.8-1时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM,诱导4h,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示目的蛋白主要以包涵体的形式存在。进一步优化表达条件,SDS-PAGE及蛋白印迹法(western blot)鉴定目的蛋白TAT-XIAP的表达形式。取TAT-XIAP包涵体蛋白溶解于8M尿素4℃过夜,离心取上清加入镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA),在变性的条件下,用20mM和50mM咪唑溶液各15mL进行洗脱,100mM咪唑溶液收集纯化的TAT-XIAP目的蛋白。SDS-PAGE鉴定该蛋白的纯化效果。将纯化后的TAT-XIAP蛋白、10%甘油和0.014mol/L的β-巯基乙醇装入透析袋,依次用6M、5M、4M、2M、1M尿素缓冲液和PBS4℃磁力搅拌进行透析,获得了复性的TAT-XIAP融合蛋白。取CEN2对数生长期的细胞,不同浓度的融合蛋白TAT-XIAP作用不同时间,MTT法检测TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞生长的影响。SD大鼠腹腔注射复性后的TAT-XIAP融合蛋白,于注射12h后断头取大脑组织,冰冻切片,厚约6μm,免疫荧光显微镜下观察TAT-XIAP融合蛋白在脑组织的分布情况。 结果:1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示pTAT-XIAP质粒DNA约4.5kb,pTAT-HA质粒DNA约3kb。pTAT-XIAP质粒DNA经NcoI/XhoI酶切鉴定,电泳结果显示在Marker约3kb处可见空载体 pTAT-HA的条带,在 Marker约1.5kb处可见 XIAP的条带。2.12%SDS-PAGE结果显示TAT-XIAP目的蛋白分子量约64kD,该蛋白主要以包涵体的形式存在,经调整诱导温度、IPTG浓度及诱导时间等进一步优化诱导条件,发现 TAT-XIAP目的蛋白仍主要以包涵体的形式存在。TAT-XIAP目的蛋白在变性条件下经镍离子亲和层析柱纯化,获得了高产量、高纯度的 TAT-XIAP目的蛋白。TAT-XIAP融合蛋白经 SDS-PAGE和western blot分析,在分子量约64kD处有一明显表达条带,实验结果与理论结果相符。3.蛋白复性后,MTT法检测TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞生长的影响,数据经统计学分析后,结果显示TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞的生长有促进作用。4.免疫荧光结果显示SD大鼠脑组织中有大量绿色荧光信号,其中以大脑皮质、基底节处多见。该蛋白主要分布在细胞浆中。PBS对照组除非特异性着色外,未见明显阳性绿色荧光信号。 结论:1.成功构建 pTAT-XIAP原核表达载体并表达出目的蛋白。2.重组蛋白 TAT-XIAP经镍离子亲和层析纯化,获得了高产量、高纯度的目的蛋白。3.重组蛋白TAT-XIAP复性成功,动物实验证实该蛋白可成功穿透血脑屏障,MTT法检测发现TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞生长有促进作用,其作用机制有待进一步研究。 收起