摘要: 背景和目的:核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)作为一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，是抗凋亡基因表达的主要激活子，在肿瘤细胞的浸润、转移及免疫逃生中发挥着重要作用。近年来的研究发现，由传统中药苦参中提取的活性成分苦参碱不仅能够... 展开 背景和目的:核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)作为一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，是抗凋亡基因表达的主要激活子，在肿瘤细胞的浸润、转移及免疫逃生中发挥着重要作用。近年来的研究发现，由传统中药苦参中提取的活性成分苦参碱不仅能够抑制肿瘤的扩散，还能够诱导肿瘤细胞的分化和凋亡，使其在临床上得以广泛应用。我们前期的研究表明，苦参碱在体外诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的过程中，能同时激活NF-κB通路，利用二硫代氨基甲吡咯烷抑制NF-κB活性，可增强苦参碱诱导HepG2细胞凋亡的作用，但其具体机制尚不明了。本实验以人肝癌HepG2细胞株为研究对象，探讨NF-κB P65沉默联合应用苦参碱对人肝癌细胞HepG2的凋亡作用及对凋亡相关基因表达的影响，以揭示抑制NF-κB通路增强苦参碱诱导HepG2细胞凋亡的可能机制。 方法: (1)构建NF-κB P65 siRNA真核表达载体，转染人肝癌HepG2细胞。RT-PCR检测NF-κB P65 mRNA的表达水平，筛选出沉默效率最高的质粒。用此质粒转染细胞，并筛选出NF-κB P65沉默稳定转染细胞株。 (2)利用流式细胞仪检测细胞周期、平板克隆形成实验、倍增时间测算探讨NF-κB P65沉默对人肝癌HepG2细胞一般生物学特性的影响。 (3)流式细胞仪检测NF-κB通路沉默联合苦参碱应用下的HepG2细胞凋亡率，RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞NF-κB P65、CD95(Fas)、Smac、Survivin的mRNA和蛋白水平表达。 结果: (1) NF-κB P65 siRNA真核表达载体构建成功，并用沉默效率最高质粒成功筛选出入肝癌HepG2细胞NF-κB P65沉默稳定转染细胞株。 (2) NF-κκB P65沉默后处于S期和G2/M期细胞比例增加，G0/G1期细胞少于对照组(P＜0.05)，转染试剂及阴性对照质粒转染对细胞周期无影响;平板克隆形成实验中，NF-κ B P65沉默的稳转细胞组形成克隆数少于对照组(P＜0.05)，而对照组、转染试剂组及阴性对照组形成的细胞克隆数无差异;同时，NF-κB P65沉默稳转细胞组倍增时间亦长于对照组(P＜0.05)。 (3)苦参碱组NF-κB P65、CD95、Smac和Survivin的表达上调，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);稳转细胞组CD95和Smac的表达上调，与对照组有差异(P＜0.05)，NF-κB P65和Survivin的表达下调，与对照组、苦参碱组有差异(P＜0.05);联合组CD95和Smac的表达上调，与对照组、苦参碱组、稳转细胞组有差异(P＜0.05)，NF-κB P65和Survivin的表达下调，与苦参碱组有差异(P＜0.05)。各组细胞凋亡率分别为3.21％、6.25％、11.82％、21.06％，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论: NF-κB P65沉默可增强苦参碱诱导的人肝癌细胞HepG2凋亡，其机制可能与NF-κB P65和Survivin的表达下调，CD95和Smac的表达上调有关。 收起