摘要: 第一章瘦素促进小鼠体外钙化型血管平滑肌细胞RANKL mRNA表达 目的:验证小鼠体外钙化型血管平滑肌细胞(calcifying vascularsmooth muscle cells，CVSMCs)表达瘦素长型受体;研究瘦素对小鼠CVSMCs矿化结节形成、ALP、RANKL(receptor activator of N... 展开 第一章瘦素促进小鼠体外钙化型血管平滑肌细胞RANKL mRNA表达 目的:验证小鼠体外钙化型血管平滑肌细胞(calcifying vascularsmooth muscle cells，CVSMCs)表达瘦素长型受体;研究瘦素对小鼠CVSMCs矿化结节形成、ALP、RANKL(receptor activator of NF-κBLigand，核因子κB配体的受体激动剂)以及OPG(osteoprotegerin，护骨素)mRNA表达的影响。 方法:利用免疫细胞化学及Western-blot的方法验证CVSMCs上有瘦素长型受体(OB-Rb)的表达;观察瘦素对小鼠CVSMCs矿化结节形成的影响，并测定其钙含量;取不同浓度的瘦素干预小鼠CVSMCs相同时间后，应用RT-PCR的方法测定小鼠CVSMCs ALP、RANKL mRNA及OPG mRNA的表达，取相同浓度的瘦素干预小鼠CVSMCs不同的时间后，应用RT-PCR的方法测定小鼠CVSMCsALP、RANKL mRNA的表达。 结果:1.小鼠CVSMCs上存在瘦素长型受体的表达。2.瘦素促进小鼠CVSMCs矿化结节的形成。3.瘦素促进CVSMCs ALP、RANKLmRNA的表达。4.瘦素对CVSMCs OPG mRNA的表达无明显影响。 结论:1.瘦素能够促进小鼠CVSMCs的钙化。2.瘦素促进小鼠CVSMCs RANKL mRNA的表达。 第二章瘦素激活ERK1/2和Akt信号途径促进小鼠钙化型血管平滑肌细胞RANKL mRNA表达 目的:在上一部分研究发现，瘦素能够促进小鼠体外CVSMCsRANKL mRNA表达，但其具体分子机制未明确。因此，本部分研究旨在探讨瘦素促进小鼠CVSMCs RANKL mRNA表达的信号转导机制。 方法:瘦素干预钙化型血管平滑肌细胞0、5、10、15、30、60min，分别提取细胞总蛋白行蛋白免疫印迹实验检测p-ERK和总ERK、p-p38和总p38、p-JNK和总JNK、p-Akt和总Akt的表达。瘦素联合ERK1/2信号转导阻断剂PD98059或PI3K信号转导阻断剂LY294002干预小鼠CVSMCs，利用Western Blot检测p-ERK1/2，ERK1/2, p-Akt, Akt的表达情况。瘦素联合ERK1/2信号转导阻断剂PD98059或PI3K信号转导阻断剂LY294002干预小鼠CVSMCs，利用RT-PCR技术检测RANKL mRNA表达水平。 结果:1.瘦素可诱导小鼠CVSMCs ERK1/2以及Akt磷酸化。2.ERK1/2信号转导阻断剂PD98059干预组可抑制瘦素促进小鼠CVSMCs RANKL mRNA表达增加效应，说明ERK信号通路在瘦素促进小鼠CVSMCs RANKL表达中起重要作用。3.PI3K信号转导阻断剂LY294002干预组也能抑制瘦素促进小鼠CVSMCs RANKLmRNA表达增加效应，说明PI3K/Akt信号通路在瘦素促进小鼠CVSMCs RANKL表达中起重要作用。 结论:1.瘦素通过激活ERK1/2信号转导途径促进小鼠CVSMCsRANKL mRNA的表达。2.瘦素通过激活PI3K/Akt信号转导途径促进小鼠CVSMCs RANKL mRNA的表达。 第三章瘦素通过上调RANKL表达促进小鼠钙化型血管平滑肌细胞钙化 目的:在上一部分研究发现，瘦素通过激活ERK1/2和PI3K/Akt信号转导途径促进小鼠CVSMCs RANKL mRNA的表达。但瘦素是否能通过调控RANKL表达促进CVSMCs钙化尚不十分明确。因此，本部分研究旨在研究瘦素是否通过促进RANKL表达来发挥促进小鼠CVSMCs钙化的作用。 方法:瘦素联合ERK1/2信号转导阻断剂PD98059或PI3K信号转导阻断剂LY294002干预小鼠CVSMCs，利用RT-PCR技术检测ALP mRNA表达水平。利用siRNA抑制小鼠CVSMCs RANKL的表达，再用瘦素干预，RT-PCR检测RANKL mRNA的表达量验证其基因沉默作用，然后RT-PCR检测ALP mRNA的表达量。 结果:1.ERK1/2信号转导阻断剂PD98059干预组可抑制瘦素促进小鼠CVSMCs ALP mRNA表达增加效应，说明ERK信号通路在瘦素促进小鼠CVSMCs ALP表达中起重要作用。2.PI3K信号转导阻断剂LY294002干预组也能抑制瘦素促进小鼠CVSMCs ALP mRNA表达增加效应，说明PI3K/Akt信号通路在瘦素促进小鼠CVSMCs ALP表达中起重要作用。3.siRNA-RANKL能够沉默小鼠CVSMCs RANKL基因。4.siRNA-RANKL能有效抑制瘦素对小鼠CVSMCs的促钙化作用。 结论:瘦素通过上调小鼠CVSMCs RNAKL的表达促进CVSMCs的钙化。 收起