摘要: 细胞色素f(cytochromef,Cytf)是叶绿体基因petA编码的参与光合电子传递链的重要的细胞色素。目前关于Cytf的报导主要集中在其结构及其与光合作用相关的功能研究上，而关于Cytf参与细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）的研究屈指可数，得到的结... 展开 细胞色素f(cytochromef,Cytf)是叶绿体基因petA编码的参与光合电子传递链的重要的细胞色素。目前关于Cytf的报导主要集中在其结构及其与光合作用相关的功能研究上，而关于Cytf参与细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）的研究屈指可数，得到的结论停留在PCD过程中伴随着Cytf的释放。对于Cytf在PCD过程中是否发挥作用及发挥怎样的作用还不清楚。 众所周知，植物衰老过程中伴随着PCD的发生。大量研究表明人工离体暗诱导叶片衰老与叶片的自然衰老很大程度上具有相似的生理生化变化和应激调控机制，即可以用来模拟自然衰老的变化。本研究以野生型日本晴水稻幼苗为实验材料，在离体暗诱导条件下，观察暗诱导不同时间的水稻叶肉细胞，发现随着暗诱导时间的延长，叶肉细胞形态由较规则的圆形逐渐变为多处内陷的不规则形状，叶绿体中类囊体垛叠层数减少，质体球（嗜锇颗粒）数目显著增多，细胞质中质体球数目也逐渐增多。伴随这一变化，免疫印迹实验证明Cytf由类囊体逐渐向细胞质迁移。暗诱导达到96h时，叶绿体开始解体，叶绿体中的质体球开始聚集，细胞质中质体球数目上升，到144h时，叶绿体完全解体，细胞形态扭曲。 为了探究Cytf的迁移与PCD的关系，判断是迁移到胞质溶胶中的Cytf诱导了PCD，还是类囊体中Cytf的减少导致相关功能的缺失间接引发了PCD，本研究设计了Cytf诱导细胞凋亡的体内和体外实验。 在体外实验中，纯化的菠菜Cytf能诱导水稻悬浮细胞来源的无细胞体系发生DNA片段化、核酸内切酶OsNuc37活化、类caspase-3蛋白酶活化。在体内实验中，构建了地塞米松(DEX)诱导的双元表达载体pTA7002-Cytf（缺失信号肽），并瞬时转化水稻叶肉细胞原生质体，诱导Cytf在细胞质中表达。westernblot分析表明10μMDEX诱导12h后，Cytf在细胞质中大量表达;类caspase-3活性分析表明诱导18h后，DEVDase活性被显著激活;细胞核的Hoechst33342染色分析表明诱导24h后，细胞核出现严重断裂。反之，以10μMDEX诱导的空载体pTA7002瞬时转化的原生质体，以及以等体积无水乙醇诱导的重组载体pTA7002-Cytf瞬时转化的原生质体中，westernblot、类caspase-3活性及Hoechst33342染色分析均未检测到Cytf的过表达、DEVDase活性的激活及细胞核的断裂等。本研究首次证实，Cytf从类囊体迁移到细胞质后，通过激活类caspase-3活性诱导了植物细胞程序性死亡。 Caspase-3蛋白酶是细胞凋亡中重要的蛋白酶，但在植物细胞中的相关研究成果还非常有限。类caspase-3蛋白酶的鉴定对于阐释Cytf诱导PCD的机制具有非常重要的意义，因此我们以野生型日本晴水稻悬浮细胞为材料提取总蛋白，以检测DEVDase活性的方式追踪目的蛋白，通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析、阴离子交换层析和Biotin-Avidin亲和层析从总蛋白中分离纯化该类caspase-3蛋白酶活性，并对纯化到的蛋白条带进行LC-MS/MS质谱鉴定，结合理化性质和生物信息学分析，初步判定水稻中的类caspase-3蛋白酶可能是一种类枯草杆菌蛋白酶。 综上所述，在植物衰老的过程中，Cytf逐渐从类囊体释放到胞质溶胶中，发挥着诱导PCD的作用，并且该PCD的发生可能依赖于类caspase-3蛋白酶的活化，而对该类caspase-3蛋白酶的纯化及质谱鉴定分析，表明该酶可能是一种类枯草杆菌蛋白酶。 收起