摘要: 水稻是世界上最主要的粮食作物之一。由于耕地面积的不断减少和人口的持续增长，粮食问题依然严峻。籼稻和粳稻的杂种F1具有更大的杂种优势，但限于其普遍存在的结实率低的现象，使得我们难以利用这种优势。研究和利用广亲和基因成为扩大杂交水稻杂种... 展开 水稻是世界上最主要的粮食作物之一。由于耕地面积的不断减少和人口的持续增长，粮食问题依然严峻。籼稻和粳稻的杂种F1具有更大的杂种优势，但限于其普遍存在的结实率低的现象，使得我们难以利用这种优势。研究和利用广亲和基因成为扩大杂交水稻杂种优势、解决粮食问题的重要课题。S5位点是影响水稻籼粳杂种胚囊育性的主效位点。本室于2008年克隆了S5位点的ORF5，杨江义通过一系列遗传分析证明了ORF5+是killer，ORF4+是partner，而ORF3+是protector。然而对ORF3、ORF4和ORF5的基因功能和作用途径知之甚少。 ORF3+和ORF3-编码热激蛋白70。ORF3-由于13bp的缺失，导致编码的蛋白-C端最后几个氨基酸差异和提前终止。ORF4+和ORF4-都编码未知蛋白。ORF4+蛋白在-C端有一个跨膜结构域，而ORF4-由于提前终止而缺少跨膜结构域。ORF5+和ORF5-编码的是结构完整的天冬氨酸蛋白酶，而广亲和品种编码的天冬氨酸蛋白酶缺失了信号肽和前肽。 我们在烟草和水稻原生质体中瞬时表达了ORF3+、ORF3-、ORF4+和ORF4-与绿色荧光蛋白融合的蛋白，证明了ORF3+、ORF3-、和ORF4-定位于内质网，而ORF4+定位于细胞膜和高尔基体。我们用免疫电镜的方法探究了ORF5+、ORF5-、和ORF5n的亚细胞定位，结果表明ORF5+和ORF5-位于细胞壁，而ORF5n是一种细胞质内的蛋白。我们还在水稻转基因植株中验证了上述结果，得到了一致的结论。 我们通过研究ORF5-GFP和ORF5-c-myc转基因BY-2悬浮细胞系，发现ORF5的加工依次经过了内质网、高尔基体和反式高尔基体网络等的加工，最后被分泌到细胞外，属于传统的分泌途径。我们还发现ORF5在加工过程中剪切了信号肽和前肽，并且还有少部分序列在加工过程中被去掉，其成熟形式为约37 kDa大小的蛋白。 为了研究ORF4+的蛋白性质，我们建立了ORF4+-GFP转基因BY-2悬浮细胞系和ORF4+-GFP转基因水稻植株。在BY-2细胞中，ORF4+-GFP定位于细胞膜和高尔基体，其所在的细胞器在蛋白转运抑制剂brefeldin A(BFA)处理下发生聚集，而对磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂wortmannin不敏感。ORF4+-GFP标记的细胞器与内吞marker FM4-64部分重合，表明ORF4+处于内吞或循环途径。ORF4+-GFP转基因水稻植株中显示了相同的结果。我们尝试了毕赤酵母表达ORF4+，但是由于表达量过低，没能用亲和纯化的方法得到较纯的ORF4+。 我们对BL、BLORF5+和BL(BL/NJ)的雌配子发生过程进行了切片观察，发现BLORF5+和BL(BL/NJ)呈现了不同的胚囊败育的模式。BLORF5+在减数分裂完成后，珠心细胞就出现异常，后来功能大孢子和珠心细胞都降解。而BL(BL/NJ)中的珠心没有异常。这种败育模式的差异反映了ORF3、ORF4和ORF5的基因型对于孢子体细胞和配子体细胞的影响。 我们通过芯片数据和RNA原位杂交方法研究了ORF3和ORF4的表达模式。结果显示，ORF4和ORF5具有非常相似的表达模式，只在雌蕊表达而在花药中不表达;ORF3在水稻多种组织中表达，但是在雌蕊和花药中表达量最高。 为了研究ORF4+、ORF5+引起胚囊败育，而ORF3+保护胚囊的分子机制，我们比较了功能大孢子时期BLORF5+、BL(NJ/DL)ORF4+以及BL(NJ/NJ)ORF4+的转基因阳性植株与阴性植株胚珠的差异表达基因。结果表明，ORF5+和ORF4+能引起胚珠细胞的内质网胁迫和细胞凋亡相关基因的差异表达;在ORF3+的保护下，内质网胁迫和细胞凋亡相关基因的差异表达很少。我们用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法检测了BLORF5+转基因阳性植株雌配子发生过程的胚珠，发现BLORF5+转基因阳性植株珠心细胞和功能大孢子出现了细胞凋亡。 我们还对BLORF5+转基因阳性植株和BL野生型植株的胚珠进行了胼胝质沉积的检测，发现BL在功能大孢子时期后就没有胼胝质的沉积，而BLORF5+转基因阳性植株的功能大孢子和珠心细胞有胼胝质的沉积。 我们根据遗传分析、分子生物学和细胞生物学的研究，提出了S5位点控制水稻籼粳杂种胚囊育性的“killer-protector”的三基因互作模型，并且证明了ORF5+和ORF4+引起ER stress和PCD，ORF3+缓解ER stress的途径。然而，我们需要更多细节了解这一途径。我们的研究成果对于培育广亲和品种、利用籼粳杂种的杂种优势具有很大的指导意义，将大大提高水稻的产量。 收起